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. 2017 Jul;38(7):631–633. [Article in Chinese] doi: 10.3760/cma.j.issn.0253-2727.2017.07.017

二例丙酮酸激酶缺乏症PKLR基因突变确证

Identification and characterization of PKLR gene mutation in two patients with erythrocyte pyruvate kinase deficiency

黄 振东 1, 施 均 1, 邵 英起 1, 聂 能 1, 张 静 1, 黄 金波 1, 李 星鑫 1, 葛 美丽 1, 郑 以州 1,✉
Editor: 刘 爽1
PMCID: PMC7342281  PMID: 28810336

丙酮酸激酶缺乏症（PKD）是一种常见的遗传性红细胞酶病，可引起遗传性非球形红细胞溶血性贫血[1]。PK活性检测是诊断PKD的传统方法，然而PK活性易受患者年龄、同工酶代谢及检测方法的影响，并且部分患者的PK活性降低不明显甚至代偿性升高，给临床诊断带来困难[2]。基因检测则不受上述因素的影响，目前已成为确诊PKD的重要手段。我们收治了2例先天性溶血性贫血患者，常规溶血检查均正常，通过二代靶向测序技术诊断为双重杂合子PKD。现报道如下并进行文献复习。

病例资料

例1，女，3岁，籍贯山东。患儿于出生后24 h即出现重度黄疸，总胆红素（TBIL）501 µmol/L，间接胆红素（IBIL）482 µmol/L，HGB 60 g/L。考虑为“溶血性贫血”，给予输注红细胞及对症治疗，黄疸有所减退。曾于院外行Coombs试验、酸溶血试验、红细胞渗透脆性试验（EOF试验）、酸化甘油溶血试验（AGLT50试验）及红细胞酶相关检查，均未发现异常。曾给予泼尼松治疗4个月，无效。患儿1岁前每月输注红细胞0.5 U，2岁时每月输注红细胞1 U，目前1个半月输注红细胞2 U。其父母无黄疸、贫血病史。入院查体：发育正常，中度贫血貌，皮肤与巩膜重度黄染，心尖部可闻及Ⅱ级收缩期杂音，肝脾肋缘下未触及。入院相关检查，血常规示：WBC 7.24×109/L，HGB 74 g/L，PLT 232×109/L，网织红细胞比例（Ret）31.34%。生化检查示：TBIL 111.4 µmol/L，IBIL 102.3 µmol/L，LDH 1 540 U/L。溶血相关检测：EOF试验、伊红-5′-马来酰亚胺标记的流式细胞术（EMA试验）、AGLT50试验、Coombs试验、酸溶血试验、冷凝集素试验、变性珠蛋白小体检查、血红蛋白A2定量、抗碱血红蛋白检测、血红蛋白电泳分析、高铁血红蛋白还原试验、热不稳定试验、异丙醇试验、变性珠蛋白试验、葡萄糖-6-磷酸酶活性检测、丙酮酸激酶活性检测、红细胞5′-嘧啶核苷酸酶活性检测均正常。B超检查：中度大，脾长10.4 cm，厚3.4 cm。其父母上述检查均未发现异常。二代靶向测序：检测红细胞膜缺陷相关基因SPTB、SPTA1、EPB41、EPB42、ANK1、SCL4A1；红细胞酶缺陷相关基因PKLR、G6PD、GSS、HK1、NT5C3A；地中海贫血相关基因HBA1、HBA2、ATRX、HBB等。发现PKD相关基因PKLR存在双重杂合突变，分别为第6外显子c.788-792del（p.263-264del）和c.823G>C（p.Gly 275 Arg）（图1）。经千人基因组数据库查询，例1 c.823G>C有相关致病报道[3]。应用常规Sanger测序法分别对患者及其父母PKLR基因12个外显子的编码区及其侧翼序列的DNA片段进行测序验证，其结果与靶向测序结果完全一致。从其父亲处遗传c.788-792del，从其母亲处遗传c.823G>C。经SIFT和PolyPhen.2数据库分析表明，这两种突变在人群中的发生率极低，对其进行蛋白质功能预测均显示为有害，考虑为本病的致病基因突变。

图1. 例1 PKLR基因第6外显子突变测序图（箭头所示为突变位点）.

图1

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A：c.823G>C错义突变；B：c.788-792del缺失突变

例2，男，38岁，籍贯河南。患者30余年前发现皮肤、巩膜黄染，伴有尿色加深，未予重视。入院前8个月无明显诱因突发胸闷、乏力，就诊于当地医院。血常规示：WBC 3.5×109/L，HGB 95 g/L，PLT 139×109/L。血生化：TBIL 103.7µmol/L，IBIL 90.44 µmol/L。阵发性睡眠性血红蛋白尿（PNH）克隆检测、Coombs试验、酸溶血试验均正常。骨髓造血细胞增生活跃。予退黄对症治疗。其父母、5个姐姐及2个哥哥均无贫血、黄疸病史。入院查体：轻度贫血貌，皮肤、巩膜黄染，肝脾肋缘下未触及。入院相关检查，血常规：WBC 3.53×109/L，HGB 96 g/L，PLT 215×109/L，Ret 4.5%。生化检查：TBIL 73.2 µmol/L，IBIL 58 µmol/L，LDH 186 U/L。上述溶血相关检测均正常。B超检查：脾轻度大，长11.4 cm，厚3.6 cm，伴有胆囊多发结石。其父母相关检查均正常。二代靶向测序：检测上述溶血相关基因，发现PKD相关基因PKLR存在双重杂合突变，分别为第9外显子c.1379T>C（p.Val 460 Ala）和第7外显子c.1045G>T（p.Val 349 Phe）。经千人基因组数据库查询，未发现相关致病报道。Sanger测序法验证表明，患者分别从其父亲处遗传c.1379T>C，从其母亲处遗传c.1045G>T（图2）。经SIFT和PolyPhen.2数据库分析表明，这两种突变在人群中的发生率极低，对其进行蛋白质功能预测均显示为有害，考虑为本病的致病基因突变。

图2. 例2 PKLR基因突变测序图（箭头所示为突变位点）.

图2

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A：第9外显子c.1379T>C错义突变；B：第7外显子c.1045G>T错义突变

讨论

PKD为常染色体隐性遗传病，是发病率仅次于葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G-6-PD）缺乏症的红细胞酶病。于1961年由Valentine等[4]首先报道。全球均见报道，大多数分布于北欧，在白色人种中发病率约为1/20万[5]。

PKD是由PKLR基因突变所致。PKLR基因位于1号染色体（1q21），编码L-PK与R-PK 2种同工酶。PKLR基因由12个外显子组成，序列全长9.5 kb。迄今为止，国内外已报道了260余种PKLR基因突变，其中大多数为基因编码区的点突变，其次为缺失和插入突变[6]。三个最普遍的突变位点依次为c.1529G>A、c.1456C>T和c.1468C>T，而且这些突变有着种族和地区分布特点。c.1529G >A最常见于北美和中北欧，c.1456C>T常见于南欧（瑞士、葡萄牙、意大利等国家），而Zanella等[7]报道c.1468C>T亚洲最为常见。但Yavarian等[8]对亚洲PKD高发地区伊朗统计发现11号外显子c.G1168G>A、c.1529G>A突变占54%。Warang等[9]报道印度最常见的突变为c.1436G>A（18.33%）、c.A992A>G（11.66%）及c.1456C>T（11.66%）。目前国内只有少数个案报道，包括c.661G>T、c.1528C>T[10]，c.119G>A、c.1015G>C、c.941G>C、c.848T>C[11]，c.809G>C、c.1330G>T、c.1339C>A[12]和c.941T>C[13]。

本研究中，2例患者诊断为先天性溶血性贫血，但病因不明，包括血红蛋白、红细胞酶学、红细胞膜异常的相关检查均未发现异常。应用二代靶向测序结合Sanger测序技术检测了先天性溶血的相关基因，发现PKLR基因编码区存在双重杂合突变。其中例1存在c.788-792del缺失突变和c.823G>C错义突变，通过Sanger测序法验证，分别遗传自父亲的c.788-792del缺失突变和母亲的c.823G>C错义突变。而例2也为双重杂合子突变，分别遗传自父亲c.1379T>C错义突变和母亲c.1045G>T错义突变。应用SIFT和PolyPhen-2数据库分析预测4种突变对蛋白质功能均为有害，其中c.823G>C有相关病例报道[3]；c.788-792del缺失突变、c.1379T>C错义突变和c.1045G>T错义突变目前未发现相关致病报道。上述3种未见报道的错义突变位点可能为今后PKD的基因诊断提供新的检测证据。

临床上PKD患者多数双重杂合子，纯合子较少。贫血严重程度差异性较大，轻的无贫血表现或轻度贫血；重者自幼发病，需依赖输血维持，主要与PK突变类型有关。本研究2例患者均为双重杂合子发病，父母均为杂合子，无临床表现。而2例患者临床表现差异较大，例1自出生即有重度贫血，频繁输血；而例2并没有明显临床症状，为轻度贫血，考虑与突变位点不同有关。2例患者及其父母常规酶学检测均未发现异常，通过基因检测而确诊。许多PKD患者PK活性下降不明显甚至增高，其确切机制尚不明确，但细胞年龄较轻、溶血发作期、大量新生红细胞进入循环、外周血网织红细胞增多、近期输血等均可导致酶活性升高。此外，PK同工酶中白细胞PKM2活性比红细胞PKR高300倍，白细胞去除不彻底亦可能明显影响酶活性的测定值。上述诸多因素均可影响PK活性。而基因测序检查则不受上述因素干扰。除可提供明确诊断的证据外，同时可发现新的基因突变。尤其是目前的二代测序技术具有速度快、准确率高、成本低、覆盖度广，与生物学表型结合更为直接等优点，能够同时检测大量基因。对于遗传性溶血性疾病及其他遗传性疾病，具有良好的应用潜力，亦为检测PKD相关的基因突变提供了更为准确和直观的诊断依据。

综上所述，二代靶向测序方法可临床用于PKD基因诊断（尤其是常规溶血检查不能确诊的病例），而且有助于发现PKLR基因新型突变类型。本研究中发现的PKLR基因新突变类型c.788-792del缺失突变、c.1379T>C错义突变和c.1045G>T错义可导致PKD的发生。

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