原发免疫性血小板减少症（ITP）是一种以血小板减少及出血风险增加为特征的获得性自身免疫性疾病。ITP在成人中的年发病率为3.3/10万[1]。ITP的发病机制目前仍不清楚。IL-37是一种天然的抗炎因子，2000年被Kumar等[2]发现。研究表明，IL-37与多种自身免疫性疾病的发病有密切关系[3]，但IL-37在ITP中的表达情况未见报道。本研究中，我们对活动性ITP（未治疗或复发）、缓解后ITP和健康人外周血IL-37、IL-18、IL-18结合蛋白（IL-18BP）、IFN-γ和TGF-β表达进行检测，探讨IL-37及相关细胞因子在ITP发病中的作用机制。
病例与方法
1．病例：自2013年7月至2014年10月在河南省肿瘤医院门诊及住院的ITP患者共40例，入组标准参照文献[4]。①活动性ITP组（20例）：新诊断ITP 13例，持续性ITP 3例，慢性ITP 4例；女14例，男6例，中位年龄31.5（21~63）岁，中位PLT 20（1~35）×109/L。②缓解组（20例）：新诊断ITP 2例，持续性ITP 9例，慢性ITP 9例；女13例，男7例；中位年龄33.5（18~66）岁，中位PLT 144（101~522）×109/L；治疗方案：单用糖皮质激素治疗12例，糖皮质激素+利妥昔单抗4例，糖皮质激素+静脉丙种球蛋白、糖皮质激素+静脉丙种球蛋白+TPO、糖皮质激素+利妥昔单抗+静脉丙种球蛋白、糖皮质激素+利妥昔单抗+静脉丙种球蛋白+TPO各1例。以20名健康查体者作为正常对照组，男9名、女11名，中位年龄37（23~60）岁，中位PLT 207（135~289）×109/L。本研究得到医院伦理委员会批准，受试者均知情同意。
2．主要试剂：Ficoll-Paque细胞分离液（天津灏洋生物制品科技有限公司产品）；TRIzol RNA提取试剂（美国Invitrogen公司产品）；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（美国Promega公司）；SYBR(r) Premix Ex Taq™（日本东洋纺株式会社）；IL-37 ELISA试剂盒（瑞士Adipogen公司）；IL-18、IL-18BP、IFN-γ以及TGF-β ELISA试剂盒（北京欣博盛生物科技有限公司）。
3．标本采集及制备：采集受试者外周静脉血2 ml，常规离心分离上层血清和下层细胞。血清置于EP管冻存于−80 °C，下层细胞采用Ficoll-Paque分层液法提取单个核细胞，−80 °C冻存。
4．Real-time PCR检测外周血单个核细胞IL-37、IL-18、IL-18BP、IFN-γ、TGF-β基因mRNA表达：将置于−80 °C低温保存的单个核细胞解冻，提取总RNA，逆转录试剂盒合成cDNA，以GAPDH为管家基因，Real-time PCR扩增应用SYBR® Premix Ex Taq™试剂盒进行，计算并比较活动性ITP、缓解后ITP与正常对照组IL-37、IL-18、IL-18BP、IFN-γ以及TGF-β基因mRNA的相对表达量。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司设计并合成（表1），PCR产物经测序验证。
表1. Real-time PCR检测原发免疫性血小板减少症患者外周血单个核细胞IL-37、IL-18、IL-18BP、IFN-γ、TGF-β基因mRNA表达引物序列.
| 基因 | 序列（5′→3′） |
扩增片段长度（bp） | |
| 上游引物 | 下游引物 | ||
| IL-37 | CTCTGCGGAGAAAGGAAG | GCTGAAGGGATGGATGAC | 101 |
| IL-18 | AAGATAGCCAGCCTAGAGGTA | TGTTATCAGGAGGATTCATTTC | 117 |
| IL-18BP | AACACACCCCCTCCTTCTCT | GAGTGCAAGGCTAAGGCATC | 211 |
| TGF-β | TGGAAACCCACAACGAAAT | CCATGAGAAGCAGGAAAGG | 444 |
| IFN-γ | GGAGACCATCAAGGAAGACA | GCGACAGTTCAGCCATCAC | 155 |
| GAPDH | GGATTTGGTCGTATTGGG | GGAAGATGGTGATGGGATT | 205 |
注：IL-18BP：IL-18结合蛋白
5．ELISA法检测血清IL-37、IL-18、IFN-γ、TGF-β蛋白浓度：按照试剂盒说明书操作。在酶标仪检测450 nm处测得吸光度（A）值，通过ELISA专用软件或者EXCLE表绘制出标准曲线，进而得出受试者血清IL-37、IL-18、IFN-γ、TGF-β浓度。
6．统计学处理：应用SPSS 22.0软件对数据进行分析，计量资料应用x±s表示，各基因mRNA的相对表达水平采用2−ΔCt方法描述。以P<0.05认为差异有统计学意义。
结果
1．ITP患者外周血IL-37、IL-18、IL-18BP、IFN-γ、TGF-β浓度：活动性ITP患者血清IL-37、IL-18、IFN-γ浓度均高于缓解后ITP组及正常对照组（P<0.05），上述因子水平在缓解后ITP组与正常对照组之间比较差异无统计学意义（P>0.05）。活动性ITP组血清TGF-β水平低于缓解后ITP组及正常对照组（P<0.05），缓解后ITP组与正常对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）。三组间IL-18BP比较差异无统计学意义（P>0.05）。详见表2。
表2. ITP患者及正常对照组外周血IL-37、IL-18、IL-18BP、IFN-γ、TGF-β浓度比较（x±s）.
| 组别 | 例数 | IL-37（ng/L） | IL-18（ng/L） | IL-18BP（ng/L） | IFN-γ（ng/L） | TGF-β（µg/L） |
| 正常对照组 | 20 | 49.34±37.26 | 284.22±156.41 | 24.36±5.78 | 225.83±78.41 | 23.91±5.14 |
| 活动性ITP | 20 | 144.54±63.98a | 511.84±319.95a | 22.30±6.51 | 348.29±145.06a | 7.44±5.59a |
| 缓解后ITP | 20 | 96.03±65.14b | 282.04±183.0b | 27.81±10.62 | 162.94±104.3b | 11.13±4.43b |
注：ITP：原发免疫性血小板减少症；IL-18BP：IL-18结合蛋白。与正常对照组比较，aP<0.05；与活动性ITP组比较，bP<0.05
2．ITP患者外周血单个核细胞IL-37、IL-18、IL-18BP、IFN-γ、TGF-β基因mRNA表达水平：活动性ITP组IL-37、IL-18、IFN-γ基因mRNA表达均高于缓解后ITP组及正常对照组（P<0.05）；活动性ITP组TGF-β基因mRNA表达水平低于缓解后ITP组及正常对照组（P<0.05）；以上各细胞因子的mRNA水平在缓解后ITP组及正常对照组间比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。三组间IL-18BP mRNA表达差异无统计学意义（P>0.05）。详见表3。
表3. ITP患者外周血单个核细胞IL-37、IL-18、IL-18BP、IFN-γ和TGF-β mRNA相对表达量（x±s）.
| 组别 | 例数 | IL-37 | IL-18 | IL-18BP | IFN-γ | TGF-β |
| 正常对照 | 20 | 1.03±0.87 | 1.12±0.79 | 1.06±0.39 | 1.21±0.42 | 1.16±0.41 |
| 活动性ITP | 20 | 4.45±0.06a | 1.52±0.43a | 1.49±0.52 | 1.62±0.28a | 0.44±0.21a |
| 缓解后ITP | 20 | 0.82±0.46b | 1.04±0.92b | 1.28±0.63 | 0.87±0.37b | 1.05±0.35b |
注：ITP：原发免疫性血小板减少症；IL-18BP：IL-18结合蛋白。与正常对照组比较，aP<0.05；与活动性ITP组比较，bP<0.05
3．活动性ITP患者细胞因子表达量之间的相关性：活动性ITP组IL-37、IL-18BP基因mRNA表达量呈正相关（r=0.84，P=0.001），IL-37、IFN-γ基因mRNA表达量呈正相关（r=0.67，P=0.029），见图1。其他细胞因子mRNA表达无相关性。
图1. 活动性原发免疫性血小板减少症患者外周血单个核细胞IL-37与IL-18结合蛋白（IL-18BP）、IFN-γ基因mRNA表达量的相关性.
讨论
ITP是一种自身免疫性疾病，血小板破坏增加及生成减少、巨核细胞成熟障碍等多种因素导致血小板数量减少[5]。在ITP发病过程中，炎症细胞通过分泌大量促炎因子及抗炎因子，破坏二者间的平衡，从而引起自身免疫紊乱，最终导致了疾病的发生[6]–[7]。IL-37是新近发现的一种天然抗炎因子，可能对多种细胞因子的表达有调控作用。本研究中，我们检测了活动性ITP、缓解后ITP及正常人外周血IL-37浓度及mRNA的表达，并观察其与IL-18、IL-18BP、IFN-γ和TGF-β的相关性，探讨IL-37在ITP发病中的可能作用机制。
IL-37是IL-1家族第7个细胞因子（IL-1F7），后根据其生物学功能改名为IL-37[8]。IL-37广泛存在于人体多种细胞和组织中，但小鼠体内缺乏IL-37的表达。IL-37主要存在于淋巴细胞、单核细胞以及皮肤表皮细胞。国外有学者研究IL-37b转基因小鼠的巨噬细胞（RAW细胞），发现过量的IL-37表达可促进IL-13等抗炎因子合成，抑制IL-1α、TNF-α、IL-6、GM-CSF、IL-1受体拮抗剂（IL-1Rα）等促炎因子的表达[9]。经脂多糖（LPS）处理过的IL-37过表达小鼠模型中，血清中IL-6、IL-1b、IL-17、IFN-γ水平减低，而IL-4、IL-10、IL-13水平升高[10]。基于这些研究，我们推测IL-37能通过影响细胞因子表达来促进Th2细胞功能，抑制Th1和Th17的免疫应答作用，从而减轻炎症反应。
Chen等[11]研究发现强直性脊柱炎患者IL-37表达水平升高。本研究显示，经治疗缓解后ITP患者的IL-37表达水平明显降低，提示IL-37可能参与了ITP的发病。为保证机体内环境稳态，ITP患者体内免疫失衡造成炎症因子的大量释放的同时，也促进IL-37等抗炎因子生成，这可能是活动性ITP患者IL-37表达量增高的原因。
IL-18是一种强烈的Th1反应诱导因子，能诱导T细胞和NK细胞产生IFN-γ，促进Thl细胞因子的极化。成熟体IL-18通过与细胞表面的IL-18R结合作用来发挥其生物学作用。IL-18能通过刺激Thl细胞和NK细胞引起免疫紊乱，在自身免疫性疾病及慢性炎症反应的发病中占重要地位。IL-18BP与IL-18有高度亲和力，与之结合可阻断其信号传导，导致IFN-γ生成减少[12]。本研究中，活动性ITP患者血清IL-18浓度及mRNA表达明显高于缓解组和对照组，而IL-18BP的表达在三组间无明显差异，另外，IL-37与IL-18BP的基因表达呈正相关。单宁宁等[13]发现，新诊断ITP患者IL-37的表达与IL-18表达呈正相关。本组病例结果有所不同，可能与纳入部分慢性ITP和持续性ITP患者有关。IL-18BP是IL-18的天然拮抗剂，而IL-37与IL-18的亲和力很低。成熟体IL-37与IL-18BP和IL-18Ra的Fc段结合IL-37可能与IL-l8BP相互作用，共同抑制IL-18的信号传导通路。
IFN-γ是Ⅱ型IFN家族的唯一成员，是一种强效的促炎性因子。IFN-γ主要由Th1细胞、CD8+毒性淋巴细胞和自然杀伤（NK）细胞产生。国内有研究表明系统性红斑狼疮（SLE）患者体内IL-37与IFN-γ表达呈正相关[14]。Nold等[10]的研究结果显示IFN-γ可以促进IL-37的生成。本研究结果显示，IL-37的基因表达与IFN-γ呈正相关，与上述研究结果相似。
除Th1、Th2细胞外，Th3细胞也参与ITP的发病。Th3细胞是一种调节性T细胞，对Th1、Th2细胞有明显抑制作用[15]，在自身免疫性疾病中发挥免疫调节的作用。1型调节性T细胞（Tr1细胞）主要分泌TGF-β、IL-10等细胞因子，能有效抑制炎性因子的产生及免疫效应细胞的增殖、活化等。ITP的发病机制与免疫失衡密切相关，Arandi等[16]研究发现ITP患者血清TGF-β水平较正常人明显降低。本研究结果亦显示，活动ITP患者血清中TGF-β水平明显低于正常人。这说明活动性ITP患者体内的Th3细胞水平下降或功能降低。Andersson[17]将ITP患者分成活动组、稳定组及缓解组，活动组血清TGF-β浓度最低，稳定组次之，缓解组最高。这种增长趋势说明随着疾病的好转，患者体内的免疫稳态正在重建，也再次证明了免疫紊乱在ITP发病中的重要作用。
宋立军[14]研究发现，SLE患者IL-37表达与TGF-β表达呈正相关。本组ITP患者这两种细胞因子表达无明显相关性。IL-37、TGF-β均来源广泛，影响其表达的因素很多，这两种因子间的相关调控十分复杂。IL-37是否可以通过调控ITP患者Th3细胞而调控免疫反应，有待进一步研究。
本研究结果初步表明，活动性ITP患者体内IL-37表达明显增高，且能调控多种细胞因子从而发挥其抗炎效应。尽管目前ITP治疗方法很多，仍有部分患者治疗无效，或者病情反复。研究表明，体内或体外的IL-37均能调控细胞因子抑制T细胞功能，减少树突细胞的分化，发挥其抗炎作用[18]。因此我们推测，对于糖皮质激素甚至切脾治疗无效的ITP患者，外源性增加血清IL-37水平或许可以成为一种新的治疗策略。
Funding Statement
基金项目：国家自然科学基金（81370615、81600097）
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