GATA2突变相关儿童原发性骨髓增生异常综合征临床及分子生物学特征

Abstract

目的

探讨我国GATA2突变相关儿童原发性骨髓增生异常综合征（MDS）的发生情况、临床特点及分子生物学特征。

方法

回顾性分析2007年1月至2018年1月129例儿童原发性MDS患者临床资料，采用二代测序技术检测GATA2及髓系恶性肿瘤相关基因突变情况。分析基因突变谱及其与临床表现型的关系。

结果

在所有129例患者中，11例（8.5%）检出GATA2胚系突变。在50例MDS伴原始细胞增高（MDS-EB）和急性髓系白血病伴MDS相关改变（AML-MRC）患者中，GATA2胚系突变占14.0%。GATA2突变多位于第二个锌指（ZF2）区。多因素分析结果显示，SETBP1体细胞突变（P=0.041，OR=9.003，95%CI 1.098~73.787）和独立的7号染色体单体（P=0.002，OR=24.835，95%CI 3.305~186.620）与GATA2胚系突变显著相关。与GATA2野生型的患者相比，GATA2突变型患者中位发病年龄更大[8（1~16）岁对6岁（1月龄~18岁），P=0.035]，更易伴有7号染色体单体（72.7%对5.2%，P<0.001），较之儿童难治性血细胞减少（RCC）更倾向于存在于MDS-EB/AML-MRC亚型中（5.1%对13.7%，P=0.111）。GATA2突变与否不影响儿童原发性MDS患者的3年预期总生存（OS）率[（80.1±4.2）%对（60.6±25.4）%，P=0.437]；在44例接受allo-HSCT患者中，GATA2突变与否对移植后3年预期OS率无显著影响[100.0%对（94.0±3.8）%，P=0.562]。

结论

GATA2突变在我国伴有7号染色体单体及年龄较大的儿童原发性MDS患者中占有较高的比例，且GATA2突变患者多进展为MDS-EB和AML-MRC。GATA2突变状态不影响儿童原发性MDS的总体生存。

骨髓增生异常综合征（MDS）是一组具有异质性的克隆性造血性疾病，儿童罕见。在儿童和青少年中，儿童难治性血细胞减少（refractory cytopenia of childhood，RCC）是最常见的亚型，常表现为全血细胞减少和低增生骨髓象[1]–[2]。儿童MDS最常见的染色体核型异常是7号染色体单体（−7/7q−），而在成人中常见的单纯5号染色体缺失（5q−）和复杂核型罕见[3]。儿童和成人MDS体细胞突变谱亦显著不同[4]–[6]。MDS可继发于先天性骨髓衰竭（IBMF），如范可尼贫血、先天性角化不良及家族性MDS/急性髓系白血病（AML）综合征。其中家族性MDS/AML综合征是由造血转录因子CEBPA、RUNX1和GATA2等缺陷导致的[7]。GATA2相关的疾病谱还包括免疫缺陷和血液系统以外的综合征，如MonoMAC综合征和Emberger综合征等[8]。GATA2突变患者在婴儿或儿童期即出现造血、免疫和淋巴系统症状，并伴有反复感染，高风险进展为MDS/AML[9]–[10]。目前我国尚无儿童MDS胚系GATA2突变情况的研究，这给实验室检查选择、预后评估及治疗决策带来一定的困难。本研究探讨GATA2胚系突变在我国儿童原发性MDS中的发生频率，并分析GATA2相关儿童MDS的临床及分子生物学特征。

病例与方法

1．病例：回顾性分析我院2007年1月至2018年1月确诊的129例儿童原发性MDS患者，MDS诊断符合2016年WHO分型诊断标准儿童MDS诊断标准[11]。包括RCC 78例（61%）、MDS伴原始细胞增高（MDS-EB）35例（27%）和急性髓系白血病伴MDS相关改变（AML-MRC）16例（12%）。排除继发性MDS。本研究经我院伦理委员会审核批准，并获得所有研究对象及（或）其监护人的知情同意。患者根据病情及治疗意愿接受免疫抑制治疗、化疗、allo-HSCT或支持治疗[12]。其中，34%（44/129）的患者接受了allo-HSCT。供者来源：同胞全相合3例，父母/同胞不全相合41例。移植方式：16%（7/44）为外周血+骨髓，82%（36/44）为外周血，2%（1/44）为外周血+骨髓+脐带血。11例GATA2突变患者中7例接受了HSCT。

2．标本采集：骨髓及体细胞对照标本取自患者初次诊断时。常规方法留取骨髓单个核细胞，提取DNA。体细胞对照DNA提取自初诊时的口腔上皮细胞。家系验证DNA提取自父母和（或）同胞外周血DNA。

3．检测方法：设计包含与IBMF、家族性MDS/AML、MDS相关的基因等在内的564个基因的全部外显子及剪接区的捕获芯片。取1 µg DNA常规方法制备DNA全基因组文库。采用GenCap液相捕获试剂盒（北京迈基诺基因科技股份有限公司产品）对文库目标区域进行捕获及定量，采用Illumina Nextseq 500测序。平均覆盖度98.1%，平均深度1 000×，95%的目的区域覆盖度在20×以上。测序后原始数据利用CCDS、人基因组数据库（HG19）、dbSNP（v138）、1 000 genomes、COSMIC、PolyPhen、SIFT等数据库进行生物信息学分析，确定致病性基因突变位点[13]，并采用Sanger测序验证。新发GATA2变异依据以下标准判断为可能致病性和疾病相关[14]：①其他患有MDS的家庭成员具有同样的突变；②具有其他GATA2缺陷相关的表型（如淋巴水肿）；③既往在GATA2缺陷中报道过的突变；④在Exome Aggregation Consortium Browser、dbSNP和Exome Variant Server数据库中未被报道的新发突变；⑤在物种间高度保守及预测致病性高的位点。骨髓细胞经过24 h培养，收集细胞常规制片，G或R显带，根据《人类细胞遗传学国际命名体制（ISCN2013）》描述核型异常。单纯7号染色体单体指经染色体核型分析及FISH检测，除7号染色体单体外不伴有其他异常核型；涉及7号染色体单体指出7号染色体单体外还伴有其他异常核型。

4．随访：所有病例随访至2018年10月。随访资料来源于住院病历、门诊病历。对随访期间死亡的病例，依病历记录或与患者家属电话联系确认。预期总生存（OS）期为确诊至死亡的时间或随访终点。共9例（7%）患者失访。中位随访时间为29（2~131）个月。

5．统计学处理：采用SPSS 22.0软件进行统计学分析。非连续变量资料采用卡方检验或者Fisher精确概率法，连续变量资料采用Mann-Whitney U检验，相关性分析采用Spearman等级相关系数，单因素生存分析采用Kaplan-Meier法，将单因素分析P<0.01的指标纳入Cox模型进行多因素分析。P<0.05为差异有统计学意义。

结果

一、GATA2相关MDS的临床及遗传学特征

1．临床特征：8.5%（11/129）的儿童原发性MDS患者具有GATA2突变。较之RCC，GATA2在MDS-EB/AML-MRC中的比例更高（5.1%对13.7%，P=0.111）。GATA2突变型患者首次诊断年龄晚于GATA2野生型患者[8（1~16）岁对6岁（1月龄~18岁），P=0.035]。GATA2突变患者更易合并7号染色体单体（72.7%对5.2%，P<0.001）。因为RCC诊断标准宽泛，我们对其中同时符合成人MDS伴多系血细胞发育异常（MDS-MLD）诊断标准[11]的患者进行分析，发现所有的GATA2突变患者均属于此组。所有的GATA2突变患者均为自发突变，无血液系统恶性肿瘤家族史。与GATA2野生型患者相比，GATA2突变患者血小板计数更高[100（17~299）×10⁹/L对36.5（2~528）×10⁹/L，z=−2.058，P=0.040]。其他实验室检查指标（外周血血红蛋白浓度、白细胞计数、中性粒细胞计数、单核细胞计数及骨髓髓系原始细胞比例）无显著性差异（表1）。

表1. GATA2突变型与野生型儿童骨髓增生异常综合征（MDS）临床特征比较.

临床特征	GATA2突变型(11例)	GATA2野生型(118例)	P值
中位年龄［M（范围）］	8(1～16)岁	6岁（1月龄～18岁）	0.035
性别（例，男/女）	7/4	70/48	1.000
MDS亚型［例(%)］			0.111
RCC	4(36.4)	74(62.7)
MDS-EB/AML-MRC	7(63.6)	44(37.3)
染色体核型［例(%)］a
7号染色体单体	8(72.7)	6(5.2)	<0.001
+8	1(9.1)	8(6.9)	0.564
复杂核型	0(0.0)	8(6.9)	1.000
正常核型	2(18.2)	77(66.4)	0.003
其他核型	0(0.0)	17(14.6)	0.357
AML/MDS家族史［例(%)］	0(0.0)	2(1.7)	1.000
HGB［g/L，M（范围）］	81(66～110)	83(34～130)	0.918
WBC［×109/L，M（范围）］	3.94(1.61～24.43)	4.00(0.91～140.30)	0.345
ANC［×109/L，M（范围）］	0.66(0.35～11.17)	0.97(0.01～14.74)	0.324
单核细胞计数［×109/L，M（范围）］	0.42(0.02～7.07)	0.23(0.01～7.79)	0.323
PLT［×109/L，M（范围）］	100(17～299)	36.5(2～528)	0.040
骨髓髓系原始细胞比例［%，M（范围）］	7.7(0～29.0)	4.5(0～30.0)	0.708

注：RCC：难治性血细胞减少；MDS-EB：MDS伴原始细胞增高；AML-MRC：急性髓系白血病伴MDS相关改变；AML：急性髓系白血病。^a 127例患者有染色体核型分析结果

2．细胞遗传学特点：11例伴有GATA2突变的MDS患者中，染色体核型异常包括7号染色体单体8例，其中非平衡易位der（1;7）（q10;p10）（导致7号染色体长臂缺失）2例；8号染色体三体1例；未检测到−5/5q−及复杂核型。在127例具有可分析染色体核型的患者中，7号染色体单体14例（11.0%），而其中8例具有GATA2突变，且诊断时的中位年龄倾向于大于6例GATA2野生型患者[11（3~16）岁对5.5（1~10）岁]。

3．GATA2突变特征：共在11例儿童MDS患者中检测到12个致病性或可疑致病性胚系突变（其中10个为新发突变），及1个意义未明突变。包括7个移码/无义突变导致的截短突变，3个错义突变，1个非移码缺失突变，1个剪接位点突变。等位基因突变频率在0.28~0.62之间。11个突变位于编码区，其中6个突变位于第二个锌指（ZF2）区（氨基酸347~398），2个位于C末端，1个位于N末端。位于非编码区的突变c.1143+2T>G位于第5内含子，邻近剪接位点。其中1例患者（例10）具有3个突变，包括位于第5内含子的c.1143+2T>G，位于ZF2区的c.1086_1087ins63（p.N36delins22）及位于ZF1区的意义未明的突变c.961C>T（p.L321F）（表2）。GATA2突变类型与血液学表型无相关性。所有患者的父母和（或）正常同胞采用Sanger测序进行了相应位点的检测，未检测到健康携带者。具有GATA2突变的患者中，最常见的体细胞突变为SETBP1（4个）、ASXL1（4个）及RUNX1（3个）突变，5例患者未检出合并体细胞突变。另有1例患者合并SAMD9突变。单因素分析提示，体细胞SETBP1（P=0.001，χ²=10.438）、ASXL1（P<0.001，χ²=13.766）、RUNX1（P=0.002，χ²=9.179）突变，单纯7号染色体单体（P<0.001, χ²=46.748），涉及7号染色体单体（P<0.001，χ²=26.229）与GATA2突变显著相关。进一步多因素分析提示，SETBP1突变（P=0.041，OR=9.003，95%CI 1.098~73.787）和单纯7号染色体单体（P=0.002，OR=24.835，95%CI 3.305~186.620）与GATA2突变显著相关。

表2. 11例GATA2突变儿童骨髓增生异常综合征（MDS）患者临床特征、治疗及转归.

例号	性别	GATA2基因型	诊断年龄（岁）	MDS亚型	染色体核型	治疗	供者	造血干细胞来源	随访时间（月）	转归
1	女	c.1160C>A(p.T387N)	1	RCC	+8	HSCT	单倍型	外周血+骨髓	14	无病存活
2	女	c.1038_1039insCGC-CAGAAGAGCCGGC(p.T347Rfs*42)	3	RCC a	−7	支持治疗	NA	NA	63	死于高白细胞瘀滞
3	男	c.1286G>C(p.S429T)	3	RCC	正常	支持治疗	NA	NA	24	存活
4	男	c.17_18del(p.E6Afs*178)	5	MDS-EB a	−7	AML方案化疗	NA	NA	30	死于高白细胞瘀滞
5	男	c.1028dupG(p.R344Kfs*40)	7	MDS-EB	正常	HSCT	单倍型	外周血+骨髓	36	存活
6	男	c.1019delC(p.S340Wfs*47)	8	RCC	−7	HSCT	单倍型	外周血	9	无病存活
7	男	c.1055G>T(p.C352F)	10	AML-MRC	der(1;7)(q10;p10),+1	AML方案化疗	NA	NA	6	死于脑梗死
8	男	c.1216_1217insGTCCAA-CAAGTCCAAGA(p.K406Sfs*77)	12	MDS-EB	−7	HSCT	单倍型	外周血	16	无病存活
9	女	c.1124delT(p.Leu375PrsX12)	14	MDS-EB a	−7	HSCT	单倍型	外周血+骨髓	23	无病存活
10	男	c.1086_1087ins63(p.N363delins222T>G、c.961C>T(p.L321F)	14	AML-MRC	−7	HSCT	单倍型	外周血+骨髓	28	无病存活
11	女	c.303delC(p.Ala103fsX116)	16	MDS-EB a	der(1;7)(q10;p10)	HSCT	单倍型	外周血+骨髓	32	无病存活

注：RCC：儿童难治性血细胞减少；MDS-EB：MDS伴原始细胞增高；AML-MRC：急性髓系白血病急性髓系白血病伴MDS相关改变；AML：急性髓系白血病；^a最终进展为AML-MRC；NA：不适用

4．GATA2缺陷有关的非血液系统表型：除1例（例5）具有p.R344Kfs*40突变的患者同时合并先天性淋巴水肿外，1例（例6）具有p.S340Wfs*47突变的患者合并先天性上睑下垂外，其他患者均无非血液系统表型。

二、GATA2相关儿童MDS预后分析

全部患者3年预期OS率为（79.1±4.3）%。RCC患儿的3年OS率显著高于MDS-EB/AML-MRC患者[（91.1±4.0）%对（59.9±8.7）%，P<0.001]。单因素分析示，GATA2突变型与GATA2野生型患者3年OS率差异无统计学意义[（80.1±4.2）%对（60.6±25.4）%，P=0.437]（图1A）。44例行allo-HSCT患者的3年OS率显著高于未行移植的患者[（95.2±3.3）%对（77.3±5.0）%，P=0.002]（图1B）。在接受移植治疗患者中，GATA2基因突变状态对移植后3年OS率无显著影响[100.0%对（94.0±3.8）%，P=0.562]。

图1. GATA2相关儿童骨髓增生异常综合征患者总生存曲线.

A：GATA2突变型与GATA2野生型；B：造血干细胞移植组（HSCT）组与非HSCT组

讨论

近年来遗传易感性在原发性MDS中的作用受到关注。本研究结果示在我国儿童原发性MDS中，GATA2突变占到8.5%。而在MDS-EB和AML-MRC的患者中，占到13.7%。这与既往文献[14]中报道的比例相似。而成人MDS患者中，GATA2突变的发生率仅为0.5%，GATA2突变相关疾病的中位发病年龄为29岁[9]，而针对儿童及青少年的研究中，GATA2相关MDS的中位发病年龄为12岁[14]，结合本研究结果及文献报道，推测GATA2相关疾病主要存在于青少年及年轻成人MDS患者中，GATA2不是老年患者的主要致病基因。

既往报道过的与GATA2突变有关的综合征包括Emberger综合征（原发性淋巴水肿、皮肤疣、耳聋）、MonoMAC综合征（严重的单核细胞、NK细胞、树突状细胞和B淋巴细胞减少，鸟结核分枝杆菌复合物感染）[8]，非血液系统表型包括性功能减退、外眦赘皮、手指变细、颈蹼、行为障碍/多动症、甲状腺功能减退、泌尿生殖系统畸形、单侧/双侧上睑下垂或胎儿水肿[15]。值得注意的是，本研究中GATA2相关的MDS均为散发，且大部分患者无GATA2缺陷相关的综合征或非血液系统的表型。而接近半数的GATA2相关非MDS疾病伴有综合征相关症状[14],[16]。在儿童MDS中高比例的新发GATA2突变及极少的无症状携带者表明该基因突变较高的外显率和表现度。本研究GATA突变发生率高，且编码区突变具有完全的外显率，但因为病例数量有限，可能存在偏倚。既往研究曾报道在超过200例患者中检测到8例无症状携带者[9]。此外，非编码区突变的无症状携带者，外显率减低既往也有报道[8],[14]。

GATA2基因编码重要的造血转录因子，其通过两个ZF与上千个基因的GATA结合结构域作用[17]。GATA2以剂量依赖的方式，通过与其他转录因子协同作用，调控早期造血[18]。GATA2胚系突变涉及截短突变多导致ZF2缺失[8],[15]。此外，目前认为ZF2内的错义突变和位于GATA2-9.5 kb调控区的非编码区变异导致半倍体剂量不足[7]–[8],[15]。GATA2体细胞突变也存在于成人髓系肿瘤中，不同的是，突变可发生于两个ZF区，既可引起功能获得亦可引起功能缺失效应[15],[19]。

与既往报道GATA2半倍体剂量不足导致血细胞减少及免疫缺陷相似，我们检测到2种单等位基因突变，包括截短突变和位于ZF2区的错义突变。但未检测到位于第4内含子的增强子区域突变。迄今为止，只有一小部分的GATA2错义突变进行了功能验证。丧失功能性突变包括在家族性MDS/AML中位于ZF2区的Thr354Met及Thr355del13，在Emberger综合征中的Arg361Leu及Cys373Arg17，在原发性AML中的Arg350_Asn351ins（体细胞突变状况不明）[20]。本研究我们未检测到上述突变。本研究及既往报道GATA2截短突变均破环了ZF2区，提示这一区域的重要性。Wlodarski等[14]研究显示非编码区突变占10.5%，且部分非编码区突变的患者具有更长的疾病稳定期，但本研究只检测到1个内含子区的突变。本研究及既往研究均未发现GATA2基因型与临床表型具有显著相关性。

高危险度MDS亚型和7号染色体单体在GATA2相关MDS中比例显著增加。相反，在GATA2相关免疫缺陷患者中，8号染色体三体（24%）多于7号染色体单体（16%）[8]。既往报道7号染色体单体在整个年龄组GATA2突变中占29%[9]，在儿童及青少年组中占70%[17]，这与本儿童队列中结果基本一致（72.7%）。而且，本研究中，2例患者为der（1;7）（q10;p10）非平衡易位，导致1q三体和7q缺失，这一变异在儿童MDS中较少见[4],[6]。既往研究[14]及本研究均证实GATA2胚系突变在伴有7号染色体单体的青少年MDS患者中比例较高，因此对这部分患者在诊断时需注意除外GATA2突变。

GATA2突变相关疾病易向髓系肿瘤转化的驱动突变尚不清楚。既往研究报道示30%GATA2突变患者可检测到同时合并ASXL1基因突变，且附加的获得性突变与疾病进展有关[21]–[22]。因此，获得性ASXL1突变被认为与GATA2突变向髓系肿瘤恶性转化有关[9],[21],[23]。但这一观点目前存在争议，首先，在更大队列的研究中，并未观察到GATA2突变患者具有更高的ASXL1突变比例，其次，之前研究得出的两者之间的联系可能是由于7号染色体单体造成的偏倚[6],[23]。其他GATA2相关MDS常见的突变有SETBP1功能获得性突变。本研究中，多因素及单因素分析均示SETBP1突变与GATA2显著相关，提示这一体细胞突变在GATA2突变的致病机制中具有重要作用。

在考虑了MDS亚型和细胞遗传学因素后，本研究中儿童原发性MDS的OS不受GATA2突变状态的影响，提示MDS亚型是影响预后的主要因素。尽管GATA2突变MDS患者更容易在初次诊断时即为MDS-EB和AML-MRC，但OS与GATA2野生型患者无统计学差异。较大系列（534例MDS患者，其中GATA2相关MDS 57例）的研究[14]亦得出与本研究相似结论：当单因素分析GATA2突变状态时，GATA2突变患者预后较差（5年预期OS率：73%对84%，P<0.05），但当纳入MDS亚型、7号染色体单体共同分析时，GATA2突变状态与OS无显著相关性。因此考虑GATA2缺陷虽具有很强的MDS倾向性，但可能不影响总体生存。这一结论需在更大规模的样本中验证。HSCT是目前唯一可以治愈GATA2相关MDS的治疗。既往NIH研究报道，GATA2突变（包括了家族性MDS/AML，肺泡蛋白沉积或反复感染）患者移植后4年OS率为54%[8]。一项针对儿童GATA2相关MDS的研究报道，HSCT后5年OS率为66%[14]。本研究中GATA2相关MDS患者的预后与上述报道相似。儿童GATA2相关原发性MDS移植后总体生存较好，可能与移植年龄较小及无GATA2相关非血液系统并发症有关。

总之，本研究表明GATA2在我国儿童原发性MDS中发生率约9%，在青少年伴有7号染色体单体的患者中占到72.7%。GATA2突变状态不影响MDS患儿的预后。与所有MDS患儿一样，应根据已知的危险因素，来决定GATA2相关MDS中HSCT的时机和预处理方案。早期诊断GATA2缺陷可以使患者的疾病监测更具有针对性，并减少了非治愈性治疗的应用，尤其是避免免疫抑制治疗。我们建议对所有儿童和年轻成人MDS患者都应进行GATA2基因突变分析，无论其是否具有家族史或者GATA2缺陷相关表型。

Funding Statement

基金项目：国家自然科学基金（81700109）；协和青年科研基金&中央高校基本科研业务费专项资金（2017320024）；国家重点研发计划（2016YFC0901503）；中国医学科学院医学与健康科技创新工程（2016-I2M-1-002、2017-I2M-3-018）；爱佑慈善基金

Fund Project: National Natural Science Funds（81700109）; Program for Peking Union Scholars and Innovative Research Team; PUMC Youth Fund & Fundamental Research Funds for the Central Universities（2017320024）; The National Key Research and Development Program of China（2016YFC0901503）; the CAMS Innovation Fund for Medical Sciences（2016-I2M-1-002, 2017-I2M-3-018）; Ai You foundation.