Abstract
目的
调查不同医院BCR-ABL酪氨酸激酶区点突变检测的准确性和一致性。
方法
由6家医院各制备10份来自于酪氨酸激酶抑制剂耐药的BCR-ABL（+）患者骨髓或外周血样本的cDNA，每份分装成6管派发，每家医院按照自身的操作程序检测共60份比对样本的BCR-ABL激酶区点突变，由北京大学人民医院结合测序图谱进行结果比对分析。
结果
37份（61.7%）比对样本的碱基及相应氨基酸突变类型6家医院报告均一致。53份样本可以确定突变类型，共涵盖23种；1份样本没有突变；6份样本由于室间图谱差异较大无法明确结果。突变比例低造成12份样本结果不一致，二者明显相关（P=0.008）；测序图谱特殊及扩增区域未覆盖各造成1份样本结果不一致；3份样本发生扩增失败；7份样本发生检测或报告错误。80.6％的结果明确的样本室间报告突变比例差值在20％以内。标本内参弱与检测失败和室间测序图谱差异大均相关。
结论
通过样本比对能够发现临床常规检测存在的问题，促进检测水平的提高。突变比例低是导致室间突变报告不一致的主要因素。
Keywords: BCR-ABL酪氨酸激酶区, 点突变, 测序图谱, 突变比例
Abstract
Objective
To investigate the accuracy and consistency of the detection of BCR-ABL tyrosine kinase domain point mutation among different laboratories.
Methods
Every one of 6 laboratories prepared 10 cDNA samples from tyrosine kinase inhibitors resistant BCR-ABL (P210 or P190) positive patients' bone marrow or peripheral blood. Each cDNA sample was divided into 6 aliquots and delivered to the laboratories. All 6 laboratories tested BCR-ABL point mutations of 60 samples according to their own protocols. Peking University People's Hospital analyzed the comparison results based on both the reports and sequencing chromatogram from all laboratories.
Results
All laboratories reported the same nucleotide and corresponding amino acid mutations in 37 samples (61.7%). Of 60 samples, 53 had confirmed mutation types, and a total of 23 types were included; 1 had no mutation; mutation types of 6 samples could not be determined because of the big differences among chromatograms from different laboratories. Low percentages of mutants were significantly related to results inconsistency (P=0.008). Inconsistent result of one sample was caused by the unique chromatogram of the mutant L248V, and one by the non-coverage amplification of PCR product from different laboratories. Amplification was failed in 3 samples. Testing or sequencing mistakes occurred in 7 samples. The differences in the mutant percentages among laboratories were less than 20% in the 80.6% of samples with confirmed results. Low internal control gene copies (ABL<10 000) were significantly related to both failed amplification and big differences among chromatograms from different laboratories (P=0.005 and <0.001, respectively).
Conclusion
Problems in the clinical routine detection of BCR-ABL point mutation could be exposed and improvement could be achieved by sample exchange and comparison. Low percentage of mutant is the main reason which causes the discrepancy of BCR-ABL point mutation results among different laboratories.
Keywords: BCR-ABL tyrosine kinase domain, Point mutation, Sequencing chromatogram, Percentage of mutant
慢性髓性白血病（CML）及Ph（+）急性淋巴细胞白血病（ALL）均具有BCR-ABL融合基因。伊马替尼等酪氨酸激酶抑制剂（TKI）靶向作用于BCR-ABL融合蛋白，使得大部分BCR-ABL（+）患者很快获得满意疗效[1]–[2]，但少部分患者会发生原发或继发耐药[3]。目前普遍认为，BCR-ABL酪氨酸激酶区单碱基突变造成相应氨基酸改变从而影响蛋白空间构象是耐药的主要机制[4]–[6]。国内外指南均建议根据突变结果决定TKI耐药患者的下一步治疗[7]–[9]。突变检测结果准确是发挥正确指导临床作用的前提。当前临床常规ABL突变检测主要采用Sanger直接测序法。目前很多医院均已开展BCR-ABL点突变的临床检测，但结果的准确性尚不知晓。2014年5月至2015年3月，国内6家医院进行了室间样本派发来比对BCR-ABL点突变的检测，旨在了解检测现状、发现问题并提出相应改进措施，以期促进检测水平的提高，使其在治疗中发挥最佳作用。
材料与方法
1．派发样本的制备：由6家医院共同制备，每家医院提供10份来自TKI耐药的CML或Ph（+）ALL患者骨髓或外周血样本的cDNA样本各60 µl，每份分装为各6份平行样本冷藏快递至各家医院实验室分别检测，每家检测同样60份样本。
2．ABL点突变及ABL拷贝数的检测：各家医院按照自身的操作程序，扩增BCR-ABL酪氨酸激酶区域，然后对PCR产物进行双向直接测序。其中5家采用半巢式PCR即一轮扩增BCR-ABL、二轮扩增BCR-ABL上的ABL的方法，1家采用一轮扩增BCR-ABL后测序的方法。北京大学人民医院采用实时定量RT-PCR(RQ-PCR）技术检测各样本内参基因ABL拷贝数[10]。
3．结果分析及统计：各家医院回报结果内容包括是否有突变、突变氨基酸类型及相应碱基和突变比例（测序图谱中突变峰占总测序峰的比例）以及各份样本的突变图谱。北京大学人民医院结合测序图谱进行结果比对分析。采用SPSS13.0软件进行χ2检验比较比率。
结果
一、比对样本组成
60份样本中，来自CML及Ph（+）ALL的患者分别为49例和11例；按照BCR-ABL类型区分，P210（＋）样本54例（90%），P190（+）样本6例（10%）。为方便比较，所有样本均根据各家的转换系数转换为国际标准化的BCR-ABL转录本水平（BCR-ABLIS）[11]，P190（+）样本的中位BCR-ABLIS为61.6%（5.3%～96.8%），P210（+）样本的中位BCR-ABLIS为30.6%（0.45%～130.2%）。
二、比对总体结果
37份样本的碱基及相应氨基酸突变类型6家医院报告均一致，一致率为61.7%（37/60）。根据各家医院回报的测序图谱和结果可以确定53份比对样本的突变类型、1份样本没有突变、6份样本无法明确正确的结果。有明确结果的53份标本共包含了23种突变类型，突变类型及涉及样本的比例分别为：M244V（7.4%）、L248V（1.9%）、G250E（14.9%）、Y253F（3.7%）、Y253H（18.5%）、E255K（9.3%）、E255V（11.1%）、E275K（1.9%）、D276G（3.7%）、V299L(3.7%）、F311I(3.7%）、T315A(1.9%）、T315I(29.6%）、F317L(11.1%）、M351T(3.7%）、E355G(1.9%）、F359I（3.7%）、F359V（5.6%）、L387F(1.9%）、H396R（1.9%）、S438C（1.9%）、E453K(1.9%）、E459K(1.9%）。涉及样本比例最高的类型（>5%）依次是T315I/A、Y253H/F、E255K/V、G250E、F317L、F359I/V和M244V。
三、不一致样本结果分析
23份比对样本结果不一致，分别由以下1项或几项原因造成：
1．12份样本（12/23, 52.2%）由于突变比例低甚至低至测序敏感度界限，导致或者突变峰很小未看到而未报告、或者测序突变峰不明显很难判断而未报告、或者测序图谱未显示出突变峰。各家医院结果一致并且能够检测到突变的36份样本中，各家医院报告的突变比例最低值≤20％的样本有6份（16.7%，6/36），另30份样本报告的突变比例最低值为30%~90%。样本突变比例低与报告不一致明显相关（12/23对6/36, 52.2％对16.7%，P=0.008）。
2．1份样本（1/23, 4.3%）为L248V型突变，由于特殊的突变峰表现（该突变形成新的剪切点导致测序峰图为特征性的双峰表现），从而2家医院未能报告出结果。
3．1份样本（4.3%）为E453K型突变，2家医院由于PCR扩增未覆盖该位点，导致无法检测到。
4．由于扩增失败导致没有PCR产物，无法测序。在3份（10.3%）样本中发生。
5．7份（30.4%）样本发生了检测及报告错误，主要包括测序图谱显示的突变与其他医院均不同、或者测序图谱与报告结果不一致如漏报明显的突变、报错突变碱基或氨基酸、或者背景峰当做突变峰报告等。
6．6份（26.1%）样本各家医院之间的测序图谱差异较大，突变点不同，因而无法判定它们正确的突变结果。
四、样本质量与突变检测的关系
比对样本结果不一致的因素中扩增失败及各家医院之间测序图谱差异大无法确定结果与样本质量之间存在明显关系。扩增失败与ABL拷贝数≤10 000明显相关（3/11对0/49, 27.3％对0, P= 0.005），由于各家医院之间测序图谱差异大而无法确定结果与ABL拷贝数≤10 000明显相关（5/11对1/49, 45.5％对2.0%, P<0.001）。
五、比对样本各家医院报告突变比例的比较
我们比较了各家医院结果一致并且能够检测到突变的36份样本各家医院报告的突变比例。中位突变比例差（6家医院报告的比例中最大值-最小值）为13%（10%～50%），47.2％的样本差值为10%，80.6％的样本差值≤20%，7份（19.4%）样本差值为30%～50%。
讨论
TKI靶向作用于BCR-ABL，为Ph（+）CML/ALL患者治疗带来革命性变化。但小部分患者会发生耐药，BCR-ABL激酶区突变是耐药的主要机制[3]–[6]。不同TKI对各个突变类型的敏感度不同，研究显示，慢性期CML患者选用突变敏感的TKI二线治疗能够延长生存[12]。因此，各大指南均推荐对于TKI耐药患者需检测ABL激酶区突变再选择合适的治疗方案。此外，BCR-ABL激酶区突变位点不固定，目前已报道近百种突变类型分布于ABL第220~500氨基酸范围内[13]。因此能够确定突变碱基位点及类型的Sanger直接测序法是目前临床常规主要方法。
直接测序法的检测结果决定了治疗措施的采用和临床研究得出的结果，因此准确性十分重要。尽管国际上已有很多关于ABL突变的临床研究报道，但是未见检测方法学的报道。有关BCR-ABL转录本水平以及BCR-ABLIS方面有一些方法学以及关于实验室间比对的报告，关于突变方面的室间比对尚未见报道。国内已广泛开展ABL突变检测，但准确性未知。为此，我们6家医院做了国内第一次ABL突变的室间比对，结果显示大部分样本结果一致，但是仍有约1/3的结果不一致，检测过程存在一些普遍问题，ABL突变检测仍待改进。
这次比对样本来自6家医院临床送检ABL突变的样本，包含了P210及P190两大主要类型的BCR-ABL；患者均为TKI治疗后耐药，BCR-ABL水平均高于主要分子学缓解（MMR）水平，即为指南中推荐突变检测时的BCR-ABL水平；突变类型包括了最常见的23种类型，并且常见类型近似于之前的报道[6],[14]，其中F317L较高比例可能与二代TKI的应用有关；因此，本次比对突变样本组成近似临床检测中ABL突变检测的实际状况，比对结果有可能反映临床常规中的真实表现。
约一半样本的结果不一致与突变比例低有关。Sanger测序法尽管有诸多优点，但是敏感度较低（约15%）。当突变比例较低尤其是在敏感度附近时，判定是否存在突变比较困难。突变是患者发生TKI耐药的主要原因之一，一些突变类型对不同的二代TKI敏感性不同，在患者表现耐药之前突变克隆有一个从无到有、从小到大的变化过程。已有数据显示与直接测序法相比，更敏感的二代测序法能够发现比例更低的突变、更早提示耐药从而可能指导临床选择最合适的二线TKI以及提前干预[15]。因此，在更敏感的突变检测具有明确的临床意义得到充分证明后，二代测序法有可能替代Sanger测序法成为未来突变检测的主要手段。
真核生物mRNA转录后剪接过程的剪接位点主要包括内含子5′端的GU和3′端的AG。第248号氨基酸密码子由CTG突变为GTG形成L248V型点突变，同时形成新的5′端GT剪接点，与81个碱基之后的AG配合造成剪接发生，导致L248V型点突变与缺失81个碱基的Δ（D248–274）突变体同时存在，突变图谱表现为自第248号氨基酸密码子开始持续杂合峰型。这是L248V型点突变的图谱特征[16]，可以通过克隆测序来明确。
根据目前已报道的突变类型，建议检测区域应介于第220~500氨基酸范围内[13]，扩增测序应包含此区域。比对结果证明有的医院ABL检测范围尚未覆盖全面，导致超出范围的突变不能检测到。此外，检测过程中的各种人为错误见于约1/3的样本中，这一点需要引起重视。
突变比例根据测序峰高度来估计，各家医院报告会有一定差异。比对显示所有样本均存在报告比例的差异，约一半的样本差别为10%，4/5的比对样本比例最大差别不超过20%，可以认为是估计误差所致。不过个别样本的差异较大，测序峰图明显显示了这种差异，说明同样的cDNA样本经过不同的扩增反应和测序之后，可能测序图谱中突变比例会明显不同。这说明，测序峰图谱显示的突变比例不能完全代表真实的突变比例，受扩增和测序过程的影响。在RQ-PCR技术发明后证实终点定量即根据PCR产物定量不准确，测序峰图突变比例的批间差异也证明了这一点。因此，如果临床报告中包含突变比例，应该做大概而非精确描述以显示其特征。
我们还发现标本质量差与扩增失败及室间测序图谱差异大明显相关。其原因主要在于与RQ-PCR相比，突变检测的扩增产物要长得多，如果RNA降解就无法成功扩增；此外质量差的样本扩增和测序的随机性增大。因此，BCR-ABL激酶区点突变检测要求更高质量的样本来保证检测的成功率及可靠性。
我们通过国内首次的BCR-ABL激酶区点突变检测的样本比对，发现了当前临床常规检测中普遍存在的问题，通过相关改进将促进检测水平的提高。比对结果显示突变比例低是导致室间突变报告不一致的主要因素之一，更敏感的测序技术如二代测序法的临床应有可能是未来的手段。
Acknowledgments
感谢上海百时美施贵宝有限公司的大力支持
References
- 1.Druker BJ, Guilhot F, O'Brien SG, et al. IRIS Investigators. Five-year follow-up of patients receiving imatinib for chronic myeloid leukemia[J] N Engl J Med. 2006;355(23):2408–2417. doi: 10.1056/NEJMoa062867. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 2.Wassmann B, Pfeifer H, Goekbuget N, et al. Alternating versus concurrent schedules of imatinib and chemotherapy as front-line therapy for Philadelphia-positive acute lymphoblastic leukemia (Ph+ ALL)[J] Blood. 2006;108(5):1469–1477. doi: 10.1182/blood-2005-11-4386. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 3.Gorre ME, Mohammed M, Ellwood K, et al. Clinical resistance to STI-571 cancer therapy caused by BCR-ABL gene mutation or amplification[J] Science. 2001;293(5531):876–880. doi: 10.1126/science.1062538. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 4.Branford S, Rudzki Z, Walsh S, et al. High frequency of point mutations clustered within the adenosine triphosphate-binding region of BCR/ABL in patients with chronic myeloid leukemia or Ph-positive acute lymphoblastic leukemia who develop imatinib (STI571) resistance[J] Blood. 2002;99(9):3472–3475. doi: 10.1182/blood.v99.9.3472. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 5.Soverini S, Colarossi S, Gnani A, et al. GIMEMA Working Party on Chronic Myeloid Leukemia. Contribution of ABL kinase domain mutations to imatinib resistance in different subsets of Philadelphia-positive patients: by the GIMEMA Working Party on Chronic Myeloid Leukemia[J] Clin Cancer Res. 2006;12(24):7374–7379. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-06-1516. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 6.Qin Y, Chen S, Jiang B, et al. Characteristics of BCR-ABL kinase domain point mutations in Chinese imatinib-resistant chronic myeloid leukemia patients[J] Ann Hematol. 2011;90(1):47–52. doi: 10.1007/s00277-010-1039-5. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 7.Baccarani M, Deininger MW, Rosti G, et al. European LeukemiaNet recommendations for the management of chronic myeloid leukemia: 2013[J] Blood. 2013;122(6):872–884. doi: 10.1182/blood-2013-05-501569. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 8.NCCN Guidelines. Chronic myelogeneous leukemia, version 1. 2015 [Google Scholar]
- 9.中华医学会血液学分会. 中国慢性髓性白血病诊断与治疗指南(2013年版)[J] 中华血液学杂志. 2013;34(5):464–470. [Google Scholar]
- 10.Qin YZ, Liu YR, Zhu HH, et al. Different kinetic patterns of BCR-ABL transcript levels in imatinib-treated chronic myeloid leukemia patients after achieving complete cytogenetic response[J] Int J Lab Hematol. 2008;30(4):317–323. doi: 10.1111/j.1751-553X.2007.00962.x. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 11.秦 亚溱, 林 振兴, 岑 建农, et al. 用于转换国际标准的BCR-ABL(P210)转录本水平的转换系数多中心确认研究[J] 中华血液学杂志. 2014;35(2):134–137. doi: 10.3760/cma.j.issn.0253-2727.2014.02.016. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 12.Jabbour E, Jones D, Kantarjian HM, et al. Long-term outcome of patients with chronic myeloid leukemia treated with second-generation tyrosine kinase inhibitors after imatinib failure is predicted by the in vitro sensitivity of BCR-ABL kinase domain mutations[J] Blood. 2009;114(10):2037–2043. doi: 10.1182/blood-2009-01-197715. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 13.Soverini S, Hochhaus A, Nicolini FE, et al. BCR-ABL kinase domain mutation analysis in chronic myeloid leukemia patients treated with tyrosine kinase inhibitors: recommendations from an expert panel on behalf of European LeukemiaNet[J] Blood. 2011;118(5):1208–1215. doi: 10.1182/blood-2010-12-326405. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 14.Soverini S, De Benedittis C, Papayannidis C, et al. Drug resistance and BCR-ABL kinase domain mutations in Philadelphia chromosome-positive acute lymphoblastic leukemia from the imatinib to the second-generation tyrosine kinase inhibitor era: The main changes are in the type of mutations, but not in the frequency of mutation involvement[J] Cancer. 2014;120(7):1002–1009. doi: 10.1002/cncr.28522. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 15.Soverini S, De Benedittis C, Machova Polakova K, et al. Unraveling the complexity of tyrosine kinase inhibitor-resistant populations by ultra-deep sequencing of the BCR-ABL kinase domain[J] Blood. 2013;122(9):1634–1648. doi: 10.1182/blood-2013-03-487728. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 16.Gruber FX, Hjorth-Hansen H, Mikkola I, et al. A novel Bcr-Abl splice isoform is associated with the L248V mutation in CML patients with acquired resistance to imatinib[J] Leukemia. 2006;20(11):2057–2060. doi: 10.1038/sj.leu.2404400. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]