前胡提取物角型吡喃骈香豆素对U266细胞增殖和凋亡的影响

Abstract

目的

探讨白花前胡提取物角型吡喃骈香豆素（＋/−）-4′-O-acetyl-3′-O-angeloyl-ciskhellactone（APC）对骨髓瘤细胞株U266细胞增殖和凋亡的影响。

方法

采用石油醚法提取APC，高效液相色谱检测其纯度，磁共振谱法进行结构鉴定。采用不同浓度的APC(0、10、20、30、40 µg/ml）作用于U266细胞不同时间（24、48 h），CCK-8法检测其对细胞增殖的影响；作用于U266细胞24 h后，采用AnnexinⅤ/PI流式细胞术及Hochest33342荧光染色法检测细胞凋亡；Western blot法检测caspase-3、caspase-8、AKT、p-AKT、ERK、p-ERK蛋白活性的变化；RT-PCR法检测人端粒酶逆转录酶（hTERT）亚基表达的变化。

结果

高效液相色谱检测APC纯度为98.8%。APC可抑制U266细胞的增殖，抑制率呈一定的浓度和时间依赖性，与空白对照组比较，抑制率差异均有统计学意义（P值均<0.01）；10、20、30、40 µg/ml APC作用24 h后U266细胞凋亡率分别为（5.63±0.21）%、（16.07±2.27）%、（24.83±1.65）%、（43.46±2.91）%，与空白对照组[（2.50±0.13）%]比较，差异均有统计学意义（P值均<0.05）；caspase-3、caspase-8蛋白表达随药物浓度增加呈上调趋势，AKT、ERK变化不明显，p-AKT、p-ERK蛋白表达随药物浓度增加而明显下调；随APC药物浓度增加，hTERT mRNA的表达下调。

结论

APC能抑制U266细胞增殖并诱导其凋亡，其凋亡机制可能与caspase-8、caspase-3、p-AKT、p-ERK蛋白表达变化以及hTERT亚基表达下调相关。

多发性骨髓瘤（MM）是浆细胞恶性肿瘤，尽管有化疗及造血干细胞移植等多种治疗手段，但除极少数接受异基因造血干细胞移植的患者可能获得治愈外，绝大多数患者仍会复发[1]。因而，MM的治疗迫切需要新的药物来提高疗效，以期取得长期缓解，甚至达到治愈。

前胡为伞形科植物白花前胡的干燥根。近年来研究发现前胡有抗心肌缺血、保护心肌、改善心脏功能、扩张血管、降低血压、抗氧化、祛痰、抗菌、解热镇痛抗炎、抑制肝药酶活性及抗肿瘤等多种作用[2]–[9]。最近香港学者报道前胡的提取物角型吡喃骈香豆素（＋/−）-4′-O-acetyl-3′-O-angeloyl-ciskhellactone（APC）可以诱导人急性髓系白血病细胞株HL-60细胞分化，促进细胞凋亡[10]，而对MM细胞的作用尚不清楚。在本研究中，我们观察APC对MM细胞株U226细胞的作用并探讨其作用机制，从而为其抗MM的临床应用提供理论依据。

材料和方法

1．药品和主要试剂：所用药材白花前胡购自华东医药股份有限公司药材参茸分公司（批号121017）。RPMI 1640培养液、PBS购自杭州吉诺生物医药技术有限公司。胎牛血清为浙江天杭生物科技股份有限公司产品。DMSO为美国Sigma公司产品。CCK-8试剂盒为碧云天生物技术研究所产品。细胞凋亡检测试剂盒为南京凯基生物科技发展有限公司产品。Hochest33342荧光染料为美国Cell Signaling Technology公司产品。caspase-3、caspase-8、AKT、p-AKT、ERK、p-ERK抗体为美国Epitomics公司产品。RT-PCR试剂盒为宝生物工程（大连）有限公司产品。

2．细胞培养：U266细胞由浙江大学第一附属医院血液病研究所惠赠。细胞悬浮培养于含10％胎牛血清的RPMI 1640培养液中，置于37 °C、5%CO₂、饱和湿度培养箱中培养。取对数生长期细胞用于实验。

3．APC提取及鉴定：取白花前胡1 kg，参照文献[9]–[11]进行APC的提取及纯化。采用高效液相色谱分析APC的纯度，经峰面积归一化法进行计算。采用核磁共振氢谱（¹H-NMR）、核磁共振碳谱（¹³C-NMR）、红外光谱（IR）、电喷雾质谱法（ESI-MS）对获得的APC进行结构鉴定。

4．CCK-8法检测APC对U266细胞增殖的抑制率：取对数生长期U266细胞，调整细胞密度为0.6× 10⁴/ml，接种于96孔板内（每孔加入细胞悬液200 µl）。实验组设APC药物终浓度为10、20、30、40 µg/ml，并设不加药细胞对照组（空白对照组）及溶剂对照组，培养24、48 h后，每孔加入CCK-8溶液20 µl, 37 °C培养3 h，采用酶标仪于450 nm波长处测定吸光度（A）值。每组实验设5个复孔，实验重复3次。APC对U266细胞的增殖抑制作用以增殖抑制率表示，按以下公式进行计算：

$$细胞增殖抑制率（\%）=（\frac{A_{对照组}-A_{实验组}}{A_{对照组}}）\times \text{1}00\%$$

5．Hochest33342荧光染色检测凋亡细胞：取对数生长期U266细胞，调整细胞密度为2×10⁴/ml，接种于12孔板内（每孔加入细胞悬液1 ml）。实验组设APC药物终浓度为10、20、30、40 µg/ml，并设空白对照组，培养24 h后收集各孔细胞于离心管内，1 200 r/min，离心5 min（离心半径为7 cm），去上清液，PBS洗涤，加Hochest33342荧光染料（10 µg/ml）100 µl，避光作用15 min，采用PBS洗涤并重悬细胞，荧光显微镜下观察并照相。每组实验设3个复孔，实验重复3次。

6．流式细胞术检测凋亡细胞：取对数生长期细胞，收集不同浓度（0、10、20、30、40 µg/ml) APC处理24 h的U266细胞，PBS洗涤，调整细胞密度为5× 10⁵ /ml，加入500 µl的结合缓冲液悬浮细胞，先后加入5 µl AnnexinⅤ-FITC，5 µl碘化丙锭（PI），室温下避光反应5~15 min，上流式细胞仪（EPISXL，美国Coulter公司产品）检测，采用CeIIgueSt软件进行资料分析。实验重复3次。

7．Western blot法检测凋亡相关蛋白表达：取对数生长期U266细胞，调整细胞密度为5×10⁴/ml，接种于6孔板内（每孔加入细胞悬液2 ml）。实验组设终浓度为10、20、30、40 µg/ml APC组及空白对照组，培养24 h后收集细胞，按照蛋白抽提试剂盒说明书提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度后，取40 µg变性后蛋白样品上样，行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳结束后将蛋白转移至PVDF膜上，用含50 g/L脱脂奶粉溶液的TBST室温封闭2 h，待测蛋白抗体4 °C封闭过夜，TBST洗膜后，加二抗室温孵育2 h, TBST洗膜，DAB显色，以β-actin为内参照，IPP光密度分析软件进行分析，以目的条带与β-actin灰度值的比值表示目的蛋白的表达水平。

8．RT-PCR法检测APC对U266细胞人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因表达的影响：收集不同浓度（0、10、20、30、40 µg/ml) APC处理24 h的U266细胞，提取总RNA，按照反转录试剂盒说明书合成cDNA。hTERT及内参β-actin基因扩增引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。hTERT基因上游引物：5′-TATGCCGTGGTCCAGAAGG-3′，hTERT基因下游引物：5′-ACAAGAAATCATCCACCAAACG-3′，扩增片段145 bp；内参β-actin基因上游引物：5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′，内参β-actin基因下游引物：5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′，扩增片段为619 bp. PCR条件：94 °C变性20 s, 55 °C退火20 s, 72延伸15 s，共30个循环。扩增产物行15 g/L的琼脂糖凝胶电泳，采用凝胶成像系统进行结果分析。

9．统计学处理：采用SPSS13.0软件进行统计学分析。数据以x±s表示，采用单因素方差分析进行统计学处理，组间差异的比较采用LSD检验，以P< 0.05为差异有统计学意义。

结果

1．APC的纯度检测：采用高效液相色谱分析，计算峰面积得其纯度为98.8%。

2．APC结构鉴定：获得的化合物为无色针晶状。其结构分析数据与文献[11]–[13]进行比对，确证其结构为APC。

3．APC对U266细胞增殖的抑制作用：U266细胞经APC（10、20、30、40 µg/ml）作用24、48 h后，APC各药物浓度组与与空白对照组比较，差异均有统计学意义（P值均<0.01），并呈一定的量效和时效关系（表1）。

表1. 角型吡喃骈香豆素（APC）对U266细胞增殖的抑制作用（％，x±s）.

组别	24 h处理组	48 h处理组
空白对照组	0	0
APC处理组
10 µg/ml	21.23±1.67a	27.19±2.00a
20 µg/ml	22.68±2.23a	28.62±1.91a
30 µg/ml	42.86±2.03a	54.51±1.89a
40 µg/ml	58.08±1.11a	59.50±1.73a

注：与空白对照组相比较，^aP<0.01；每组实验设5个复孔，实验重复3次

4．Hochest33342荧光染色检测凋亡细胞：不同浓度APC(0、10、20、30、40 µg/ml）作用U266细胞24 h后，Hochest33342荧光染色后于荧光显微镜下观察，发现空白对照组成活细胞极少量被染成淡蓝色，随药物浓度的增加，被紫外光激发出的蓝色荧光增强，且荧光强度随药物浓度的增加而增强，说明APC可诱导U266细胞的凋亡，且呈剂量依赖性（图1）。

图1. Hochest33342荧光染色法检测角型吡喃骈香豆素（APC）对U266细胞凋亡的影响.

A：空白对照组；B~E：分别为10、20、30、40 µg/ml APC处理组

5．流式细胞术检测细胞凋亡：空白对照组的细胞凋亡率为（2.50±0.13）%，10、20、30、40 µg/ml APC处理组细胞凋亡率分别为（5.63±0.21）%、（16.07± 2.27）%、（24.83±1.65）%、（43.46±2.91）%，与空白对照组比较差异均有统计学意义（P值均为0.000）。结果显示APC可诱导U266细胞凋亡，凋亡率随APC药物浓度增高而增加，呈剂量依赖性（图2）。

图2. 流式细胞术检测角型吡喃骈香豆素（APC）对U266细胞凋亡的影响.

A：空白对照组；B~E：分别为10、20、30、40 µg/ml APC处理组

6．Western blot法检测凋亡相关蛋白表达：不同浓度APC(10、20、30、40 µg/ml）处理U266细胞24 h后检测AKT、p-AKT、caspase-3、caspase-8、ERK、p-ERK蛋白的表达，结果显示，与空白对照组相比，AKT、ERK无明显变化，p-AKT、p-ERK蛋白表达随药物浓度增加而下调，caspase-3、caspase-8蛋白表达随药物浓度增加而增加（图3）。

图3. Western blot检测角型吡喃骈香豆素（APC）对U266细胞蛋白表达的影响.

1：空白对照组；2~5：分别为10、20、30、40 µg/ml APC处理组

7．RT-PCR法检测端粒酶亚基hTERT基因表达：结果显示不同浓度APC(10、20、30、40 µg/ml）处理24 h后，U266细胞内hTERT基因表达受到不同程度的影响，随药物浓度增高，hTERT基因表达下调越明显（图4）。

图4. RT-PCR法检测角型吡喃骈香豆素（APC）对U266细胞hTERT表达的影响.

M：Marker；1：内参照β-actin；2~5：分别为10、20、30、40 µg/ml APC处理组+内参照β-actin 基因扩增引物；6：空白对照组；7~10：分别为10、20、30、40 µg/ml APC处理组+hTERT 基因扩增引物

讨论

白花前胡是一种传统中药，具有疏散风热、降气化痰的功效。白花前胡主要的化学成分为香豆素类化合物，还含有挥发油类及D-甘露醇等其他成分。白花前胡香豆素类化合物以角型吡喃香豆素类成分为主。白花前胡香豆素类活性成分具有抗肿瘤作用[9]–[10]。

PI3K/Akt/mTOR信号通路参与调节端粒酶活性、血管形成、肿瘤侵袭等过程，与肿瘤细胞生存、凋亡密切相关[14]，抑制该信号通路可有效促进肿瘤细胞凋亡。p-AKT蛋白的高水平表达是重要的人体肿瘤发生的特征[15]。在本研究中我们发现U266细胞经APC作用后检测到的总AKT蛋白表达未受明显影响，而p-AKT蛋白表达随药物浓度增加而下调，推测APC抑制U266细胞增殖并诱导凋亡可能与该信号通路相关。

Ras/MeK/ERK通路是所有真核细胞内存在的细胞分裂素活化蛋白激酶（MAPK）众多通路之一，主要参与细胞生长、增殖、分化及凋亡等过程[16]。MAPK信号通路是连接细胞内因子表达和细胞外刺激的桥梁，在肿瘤药物治疗疾病中发挥着重要作用。有文献报道ERK的过度表达与多种肿瘤治疗耐药存在正相关[17]。我们的研究结果显示U266细胞p-ERK蛋白随药物浓度增加而明显下调，提示APC有逆转MM细胞药物耐药的可能。

caspase蛋白家族是诱导细胞凋亡的核心，参与两条凋亡途径。caspase-3是caspase级联反应的最终效应酶，是凋亡信号通路下游的效应半胱氨酸，caspase-3的活化是决定细胞进入凋亡程序的关键，参与降解凋亡过程中的细胞底物[18]。我们的结果显示caspase-8、caspase-3蛋白表达均随APC药物浓度增加而上调，提示当APC作用于U266细胞后，产生死亡效应激活caspase-8蛋白，出现级联反应进而激活下游的caspase-3蛋白，最终导致细胞凋亡。

肿瘤细胞不断增殖分化与端粒酶活性及端粒长度密切相关，hTERT具有维持端粒酶活性及端粒长度的作用[19]，因而hTERT与肿瘤细胞寿命密切相关。在本研究中我们发现，随着APC浓度的增加U266细胞中hTERT基因表达下降，提示APC抑制U266细胞增殖与抑制hTERT活性有关。

综上，在本研究中我们证实了前胡提取物APC可以明显抑制U266细胞增殖并诱导其凋亡，其机制可能与下调p-AKT、p-ERK蛋白表达、激活caspase-8、caspase-3及hTERT基因表达下降密切相关。

Funding Statement

基金项目：浙江省中医药科学研究基金（2012ZA038）