针对CD4膜蛋白的CAR-T细胞抗T细胞淋巴瘤的活性研究

Abstract

目的

探讨针对CD4膜蛋白的CAR-T细胞对CD4⁺T细胞淋巴瘤细胞的靶向特异性杀伤作用。

方法

采用重组DNA技术构建含4-1BB共刺激分子的第二代针对CD4的CAR慢病毒载体，应用293T细胞包装慢病毒，采用流式细胞术检测T细胞的转染效率及T细胞亚群动态变化，采用流式细胞术微球法检测培养上清中IFN-γ浓度。

结果

①构建的慢病毒载体转染激活的T细胞后CAR膜蛋白阳性率达到50.0%~70.0%。T细胞激活后部分CD8⁺T细胞弱表达（dim）CD4膜蛋白。T细胞转染针对CD4的CAR慢病毒后CD4⁺ T细胞、CD8⁺ CD4^dim T细胞逐渐被清除。②CAR-T细胞、对照组T细胞（空载体转染的T细胞）以8∶1效靶比分别与CD4⁺人T细胞淋巴瘤细胞株KARPAS 299细胞共培养24 h，杀伤效率分别为（96.9±2.1）%和（11.2±3.1）%，前者明显高于后者（t=7.137，P=0.028）。③CAR-T细胞单独培养，与转染慢病毒载体表达人CD4的K562细胞（K562-CD4细胞）、K562细胞共培养后上清中IFN-γ浓度分别为（1 785±268）、（15 648±2 168）、（1 978±354）pg/ml，CAR-T细胞与K562-CD4细胞共培养上清IFN-γ浓度明显高于其他两组，差异有统计学意义（P<0.01）。

结论

CD4特异性CAR-T细胞效应细胞免疫表型为CD8⁺ CD4⁺ T细胞，在体外具有杀伤正常CD4⁺ T细胞和CD4⁺ T细胞淋巴瘤细胞的活性，对于CD4^dim T细胞也有较好的清除活性。

T细胞淋巴瘤常以结外病变居多，按照临床病理学特征主要分为成人T细胞性白血病/淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤未定型、血管免疫母T细胞淋巴瘤、皮下脂膜炎样T细胞淋巴瘤、皮肤γδT细胞淋巴瘤、肝脾T细胞淋巴瘤、肠病型肠道T细胞淋巴瘤等[1]。T细胞淋巴瘤的疗效和预后较B细胞淋巴瘤差，而其疗效的提高有赖于针对T细胞淋巴瘤发生的原癌基因的靶向治疗新型药物、针对其免疫表型的抗体治疗等[2]–[4]。大部分外周T细胞淋巴瘤、间变大细胞淋巴瘤和血管免疫母T细胞淋巴瘤表达膜CD4抗原，针对CD4的治疗性单抗应用于T细胞淋巴瘤治疗，患者耐受性良好无严重不良反应[5]–[6]。

针对CD19的CAR-T细胞应用于B细胞急性淋巴细胞白血病（ALL）治疗，完全缓解率可达90%[7]–[9]。鉴于CAR构建元件包括单抗的单链可变区（scFv）、铰链区、跨膜区和共刺激信号区、CD3zeta胞内信号区[10]–[11]，我们构建了针对CD4单抗scFv片段构成的CAR，通过慢病毒载体转染T细胞并观察其对CD4⁺T细胞的杀伤活性。

材料和方法

1. 主要试剂与仪器：RPMI 1640培养基、高糖DMEM培养液、TRIzol、Lipofectamine 2000、αCD3/CD28磁珠及PCR仪均为美国Gibco公司产品，X-Vivo 15无血清培养基为美国Lonza公司产品，重组人IL-2（rhIL-2）、rhIL-7和rhIL-15购自美国Peprotech公司。无内毒素质粒大提试剂盒购自德国QIAGEN公司，Polybrene购自美国Sigma公司，细胞因子CBA微球试剂盒购自美国BD公司。ONE-Glo Luciferase活性检测试剂盒购自美国Promega公司。FC500流式细胞仪为美国Coulter公司产品。Varioskan Flash多功能读数仪为美国Thermo公司产品。

2. 细胞株培养：人CD4⁺T细胞淋巴瘤细胞株KARPAS 299细胞购自美国菌种保藏中心（american type culture collection，ATCC），在实验室自行转染含萤火虫荧光素酶的慢病毒，并筛选稳定表达萤火虫荧光素酶的单克隆细胞。转染慢病毒载体表达人CD4的K562细胞（K562-CD4细胞）由本实验室制备。KARPAS 299、K562-CD4、K562细胞用RPMI 1640培养基+10%胎牛血清培养。

3. 慢病毒载体构建及浓缩制备：构建Lenti-CD4-CAR慢病毒载体。应用Lipo3000脂质体转染法分别将Lenti-CD4-CAR慢病毒载体质粒、Gag-pol质粒、VSV-G质粒共同转入293T包装细胞系，培养24~72 h时收集病毒上清。慢病毒上清经离心沉淀后采用定量PCR法滴定慢病毒滴度。

4. 流式细胞术检测Lenti-CD4-CAR在T细胞中的表达：调整健康志愿者外周血单个核细胞密度为2.0×10⁶/ml，按2∶1比例加入CD3/CD28磁珠体外活化3 d，第4天加入150 U/ml rhIL-2，于37 °C、5% CO₂、饱和湿度孵箱中扩增2 d。经流式细胞术验证CD3阳性率均>98%。感染复数（MOI）=5时，加入慢病毒悬液至激活的T细胞悬液，添加Polybrene 6 µg/ml，1 200×g室温条件离心2 h促进转染。收集慢病毒转染4 d后T细胞，用含5 g/L牛血清白蛋白、0.9 g/L叠氮钠的PBS液洗涤3次。按照说明书加入生物素标记的Protein L，洗涤去除多余游离Protein L，随后加入链亲和霉素-PE避光孵育30 min后洗涤、重悬，加入7-AAD孵育10 min后上流式细胞仪检测，分析活细胞群体CAR表达。

5. 萤火虫萤光素酶化学发光法检测CAR-T细胞的体外杀伤活性：采用V形底96孔板进行效应细胞（CAR-T细胞、空载体转染的T细胞）与靶细胞（KARPAS 299细胞）混合培养。每孔接种1×10⁵个KARPAS 299细胞，转移至1.6 ml EP管离心收集细胞，按效靶比0.5∶1、1∶1、2∶1、4∶1、8∶1进行分组，采用无血清培养基补足终体积至200 µl，37 °C培养24 h。培养结束后转移100 µl细胞悬液至96孔平底板，加入100 µl ONE-Glo Luciferase活性检测试剂，室温孵育10 min后用Varioskan Flash多功能读数仪[购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司]检测。杀伤活性计算公式为：

$$杀伤活性(\%)=\frac{杀伤{率}_{样品孔}-杀伤{率}_{基线孔}}{1-杀伤{率}_{基线孔}}\times 100\text{\%}$$

6. 流式细胞术微球法检测培养上清IFN-γ蛋白水平：无血清培养基调整效应细胞（CAR-T细胞、空载体转染的T细胞）密度为1×10⁶/ml，靶细胞为K562-CD4细胞、K562细胞，效靶比为1∶1。CAR-T细胞实验分组：①CAR-T细胞单独培养组；②K562-CD4细胞+CAR-T细胞共培养组；③K562细胞+CAR-T细胞共培养组。空载体转染的T细胞实验分组同CAR-T细胞。培养24 h后收集培养上清，按照试剂盒说明书进行操作，上流式细胞仪检测IFN-γ表达水平，应用FCAP Array软件分析数据。

7. 统计学处理：采用SPSS18.0软件进行统计学分析。每组设3个复孔，实验重复3次。数据以均值±标准误表示，进行t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1．Lenti-CD4-CAR-4-1BB慢病毒表达质粒构建：成功构建针对人CD4的CARLenti-CD4-CAR-4-1BB（由抗人CD4的单链抗体、CD8α的铰链区和跨膜区及4-1BB胞内区、CD3zeta的胞内信号结构域构成），慢病毒表达转移质粒经限制性内切酶EcoRI-BamHI双酶切后所得长片段为8 500 bp左右，短片段为1 500 bp左右，且采用针对EF-1α的引物正向测序确认DNA序列无误，由此可以证明Lenti-CD4-CAR-4-1BB的编码基因插入位点正确（图1）。DNA测序结果显示Lenti-CD4-CAR-4-1BB的编码序列与设计序列完全一致。收集293T细胞制备的慢病毒上清液，超速冷冻离心机浓缩，应用定量PCR法测定活病毒滴度（浓缩后慢病毒滴度为1.0×10⁸ TU/ml）。

图1. 针对CD4的CAR结构示意图（A）及慢病毒载体酶切后电泳图（B）.

M：Marker；1：无酶切；2：酶切后

2．T细胞CAR的表达：CAR在T细胞中稳定表达对于CAR-T细胞发挥杀伤靶细胞作用是非常重要的。结果显示空载体慢病毒转染的T细胞中Protein L-PE阳性率低于4.5%，Lenti-CD4-CAR-4-1BB载体慢病毒转染的T细胞中Protein L-PE阳性率50.0%~70.0%（图2）。

图2. 流式细胞术检测针对CD4的CAR慢病毒载体转染T细胞效率.

A：空载体慢病毒转染T细胞后；B：针对CD4的CAR慢病毒载体转染T细胞后

3．CAR对T细胞亚群的影响：慢病毒转染T细胞4 d后CD4⁺ T细胞为1.4%~2.0%，可见少量CD8⁺CD4^low T细胞，提示T细胞表达CAR能够识别CD4分子并激活T细胞杀伤功能。慢病毒转染T细胞7 d后CD4⁺ T细胞和CD8⁺CD4^low T细胞消失，主要为CD8⁺ T细胞，少量为CD4⁻ CD8⁻ T细胞（图3）。提示构建的CAR能够介导激活T细胞清除CD4⁺ T细胞和CD8⁺ CD4^low T细胞。

图3. 流式细胞术检测针对CD4的慢病毒转染后CAR-T细胞中CD4⁺T细胞亚群变化.

A：转染前；B：转染后第4天；C：转染后第7天

4．CAR-T细胞对靶细胞的杀伤活性：结果显示CAR-T细胞与KARPAS 299细胞共培养24 h后，CAR-T细胞对KARPAS 299细胞的杀伤作用明显强于对照组（空载体转染的T细胞组），不同效靶比组间差异均有统计学意义（P值均<0.05）（表1）。

表1. 针对CD4的CAR-T细胞对KARPAS 299细胞的特异性杀伤活性（%，x±SE）.

组别	不同效靶比
	0.5∶1	1∶1	2∶1	4∶1	8∶1
CAR-T细胞组	25.8±4.5	56.0±5.4	92.3±6.2	94.1±4.3	96.9±2.1
对照组	1.3±0.5	2.4±1.0	6.7±1.8	9.6±2.1	11.2±3.1
t值	6.723	6.980	7.340	7.523	7.137
P值	0.035	0.031	0.020	0.017	0.028

注：对照组：空载体转染的T细胞组。每组设3个复孔，实验重复3次

5．CAR-T细胞对靶细胞IFN-γ表达水平的影响：结果显示，CAR-T细胞与K562-CD4细胞共培养上清中IFN-γ表达水平高于其他两组，差异有统计学意义（P<0.01）（表2）。空载体转染的T细胞共培养组各组间差异无统计学意义（P>0.05）。

表2. 针对CD4的CAR-T细胞对K562细胞IFN-γ表达水平的影响（pg/ml，x±SE）.

组别	对照组	CAR-T细胞组
T细胞单独培养组	583±50	1 785±268
T细胞+K562细胞共培养组	679±66	1 978±354
T细胞+K562-CD4细胞共培养组	679±65	15 648±2 168a

注：对照组：空载体转染的T细胞组；K562-CD4细胞：表达人CD4的K562细胞；^a与其他两组比较，P<0.01。每组设3个复孔，实验重复3次

讨论

T细胞淋巴瘤是起源于胸腺后或成熟T细胞的一组异质性淋巴瘤，在我国所有淋巴瘤中所占比例高达30%以上[1]。可供选择的一线治疗方案包括CHOP、HyperCVAD/MTX-AraC、EPOCH方案，对于年轻患者可考虑在疾病早期行造血干细胞移植。与传统化疗相比，自体造血干细胞移植可提高低危T细胞淋巴瘤患者的长期生存率，但对复发和难治的T细胞淋巴瘤患者的疗效较差，异基因造血干细胞移植后具有移植物抗淋巴瘤效应，但移植相关死亡率较高[12]。

大多数T细胞淋巴瘤呈CD4⁺，部分为CD8⁺、CD4⁺CD8⁺[13]。d'Amore等[6]研究发现，针对CD4的单抗联合化疗药物用于间变大细胞淋巴瘤、血管免疫母细胞T细胞淋巴瘤治疗后，患者外周血CD4⁺T细胞数减少，但是无抗体治疗相关严重感染发生。膜蛋白CD4高表达于辅助性T细胞表面、弱表达于单核细胞表面，造血干细胞不表达。鉴于针对CD19的CAR-T细胞治疗在B细胞ALL患者临床试验中取得良好的疗效[7]，且目前T细胞淋巴瘤患者化疗、造血干细胞移植疗效差，我们设计了针对CD4胞外区的CAR慢病毒载体，其中的单抗针对的CD4具体表位不明，不同表位可能影响CAR-T细胞识别靶细胞及免疫突触的形成[14]。采用Protein L染色法，我们构建的慢病毒载体转染正常人T细胞后可获得高达50.0%~70.0%的阳性T细胞。有研究者报道CD8⁺ T细胞被激活后弱表达CD4[15]。我们在研究中也发现体外αCD3/CD28磁珠激活部分CD8⁺ T细胞弱表达CD4，针对CD4的CAR-T细胞培养7 d后其中的CD4⁺T细胞被清除，而且CD8⁺CD4^low+ T细胞也被清除。提示我们构建的CAR能够介导激活T细胞，在体外与表达CD4的靶细胞形成免疫突触并杀伤靶细胞，且具有较高的亲和力，可以杀伤弱表达CD4的靶细胞。

人体CD4⁺ T细胞具有重要的抗感染、抗肿瘤作用。针对CD19的CAR-T细胞治疗ALL后患者出现低球蛋白血症，患者需要定期输注免疫球蛋白。在针对CD4的CAR中加入单纯疱疹病毒胸苷激酶、诱导性caspase 9、截短的表皮生长因子受体（EGFRt）等自杀基因元件有利于清除CAR-T细胞，促进患者正常CD4⁺ T细胞免疫重建。B细胞淋巴瘤患者CAR-T细胞治疗的有效率及CAR-T细胞体内扩增倍数低于B细胞ALL患者，可能与淋巴瘤患者前期多次应用利妥昔单抗免疫清除外周血B细胞而出现低B细胞血症有一定关系。鉴于CD4⁺ T细胞淋巴瘤患者的外周淋巴细胞主要为T细胞，其中的正常CD4⁺ T细胞及循环CD4⁺ T细胞淋巴瘤细胞均可以作为针对CD4的CAR-T细胞的靶细胞，理论上针对CD4的CAR-T细胞可以激活并大量增殖，并以较高的效靶比清除CD4⁺淋巴瘤细胞，提高CAR-T细胞治疗的安全性。

综上，在本研究中我们成功构建了含4-1BB共刺激分子、靶向CD4抗原的第二代CAR慢病毒载体，具有较高的转染激活T细胞效率，体外具有杀伤CD4⁺ T细胞及弱表达CD4的靶细胞活性。

Funding Statement

基金项目：江苏省科教强卫工程-临床医学中心（ZX201102）；国家临床重点专科建设项目（201202017）；国家高技术研究发展计划（863计划）（2012AA02A505）；国家自然科学基金（81300444）；江苏省自然科学基金（BK20130273）

Fund program: Jiangsu Provincial Key Medical Center and the Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions (ZX201102); National Clinical Key Specialty Development Project and National Public Health Grand Research Foundation (201202017); National High Technology Research and Development Program of China 863 Program (2012AA02A505); National Natural Science Foundation of China (81300444); Natural Science Foundation of Jiangsu Province (BK20130273)