急性髓系白血病中组蛋白甲基化修饰调控异常及相关靶向治疗研究进展

急性髓系白血病（AML）是一类高度异质性疾病，目前临床上主要通过化疗及造血干细胞移植（HSCT）进行治疗，这些治疗方法仅在一些特定亚型的白血病患者中有较好的疗效，且在80%的60岁以上患者中不良反应发生率较高[1]。对AML患者的高通量测序结果表明，大多数AML相关的基因突变都影响了下游转录因子或重要的表观遗传调控元件。值得注意的是，染色体易位引发的白血病大多伴有转录因子以及表观遗传修饰的异常调控[2]，在核型正常的AML以及融合基因如MLL（Mixed lineage leukemia）导致的AML中，在白血病早期阶段往往存在着转录因子及表观遗传修饰的突变，这也是白血病发生耐药复发的主要原因[3]。通常情况下，参与表观遗传调控的分子根据其功能可分为“Writer”、“Eraser”、“Reader”三类。其中，“Writer”指建立DNA甲基化或组蛋白修饰的一类蛋白；“Eraser”指去除DNA甲基化或组蛋白修饰标记的一类蛋白；而“Reader”则是指结合在修饰表位从而促进表观事件发生的一类蛋白[4]。最新AML发病机制的研究表明，表观遗传修饰酶因其保守的结构和催化亚基可能成为难治性AML的潜在治疗靶点。本文中我们将着重阐述AML，特别是MLL重排类AML的组蛋白甲基化修饰的异常调控及相关靶点的临床研究现状，并对表观遗传学靶向治疗进行展望。

一、组蛋白甲基转移酶（HMT，Writer）的异常调控

根据甲基化残基修饰位点的不同，组蛋白甲基化对于基因表达的调控既可是正向也可是负向[5]。组蛋白甲基化修饰包括赖氨酸和精氨酸残基的单甲基化（me1）、二甲基化（me2），以及赖氨酸三甲基化（me3）。哺乳动物细胞中转录激活型H3K4me3主要由Trithorax家族蛋白HRX/MLL催化，而与之相拮抗的转录抑制型H3K27me3则是由Polycomb repressor complex 2（PRC2）-EZH1/2完成[6]（图1）。有趣的是，无论是Trithorax还是Polycomb家族蛋白在AML中均存在高频率突变[7]。

图1. 组蛋白甲基化/去甲基化调控网络示意图.

在转录激活修饰如H3K4、H3K36、H3K79等中，甲基转移酶水平的升高以及去甲基化酶的降低共同促进下游基因的转录激活；而在转录抑制修饰如H3K9、H3K27等中，甲基转移酶水平的降低以及去甲基化酶水平的升高共同抑制下游基因的转录

Polycomb group（PcG）蛋白属于转录抑制因子，通过组装成为转录抑制复合物PRC来调控下游基因的转录，在调控细胞分化并维持细胞特性中发挥着重要作用。PcG蛋白家族至少可分为两类：PRC1和PRC2，第三类PcG蛋白仅在果蝇中存在。PcG蛋白家族在进化中高度保守。BMI-1是PRC1复合物中的重要组成蛋白，主要表达于干祖细胞，研究发现在多种肿瘤中BMI-1均存在异常表达，并与肿瘤的耐药复发相关[8]–[9]。研究表明，BMI-1的高表达预示着骨髓增生异常综合征（MDS）患者的不良预后[9]。而PRC2复合物亚基EZH2也常在肿瘤中发生异常突变。EZH2是H3K27甲基转移酶，其编码基因位于7号染色体长臂（7q）。在弥漫大B细胞淋巴瘤等肿瘤中常可见EZH2的高表达以及H3K27me2/3水平的升高[10]–[11]。此外在MDS、慢性粒-单核细胞白血病（CMML）以及原发性骨髓纤维化（PMF）患者中，存在EZH2错义、无义以及移码突变[12]–[13]。对于这几种EZH2突变的体外研究表明，这些突变使得EZH2丧失H3K27甲基转移酶功能。髓系肿瘤常伴有7q异常，其发病机制也与EZH2介导的H3K27甲基化异常调控相关，该位点异常修饰常导致干细胞自我更新相关基因的表达紊乱[14]。在12例7号染色体单亲二倍体（uniparental disomy）患者的研究显示，有9例患者出现了EZH2功能缺失型突变[12]。然而在B细胞淋巴瘤中，EZH2则通常为功能获得型突变（gain of function）[10]。在小鼠模型中敲除EZH2可使小鼠产生MDS样症状，提示在某些髓系肿瘤中EZH2可能发挥抑癌基因的功能[15]。

此外，PcG家族另外一个蛋白ASXL1在AML中的突变失活与不良预后以及较低完全缓解率相关[16]。尽管其分子机制尚不明确，但敲除ASXL1后会导致PRC2介导的H3K27me3缺失并使得HOXA家族基因如HOXA5及HOXA9的表达上调[17]。而过表达ASXL1则导致H3K27me2/3修饰水平升高并抑制HOXA基因的表达水平，同时可抑制细胞增殖[17]。ASXL1还可与BAP1基因相互作用，在小鼠模型中敲除其中任何一个基因，均可导致小鼠发生类MDS疾病[18]。在小鼠造血系统中特异性敲除ASXL1可导致细胞分化异常，包括髓系增生和红系增生。同时将ASXL1失活的LSK或全骨髓细胞移植受体小鼠可导致受体小鼠发生类MDS疾病[19]。除了ASXL1外，JARID2也同样被报道可作为辅助因子协助PRC2募集下游靶基因。有研究表明，JARID2的获得性突变与MDS的恶性转归呈正相关[20]。综上所述，这些研究表明PcG家族蛋白在血液系统肿瘤中起重要的调控作用。

MLL作为Trithorax家族蛋白，是重要的H3K4甲基转移酶并包含有复杂功能的结构域，其中包括N端的AT hook和CXXC以及C端的SET功能域。SET结构域介导了MLL蛋白酶活性，而MLL基因易位后通常丧失SET结构域并导致AML的发生[21]。MLL基因融合是指MLL基因C端的SET结构域被不同的融合蛋白取代，主要包括AF4、AF6、AF9、AF10、ELL以及ENL。这几类融合蛋白可募集多种蛋白形成复合物，其中包括转录延伸复合物如转录延伸促进因子b（P-TEFb）、聚合酶相关因子复合物、BRD3/4，以及关键HMT如DOT1L和蛋白精氨酸甲基转移酶（PRMT1）等共同促进下游基因的转录激活[5]。

DOT1L是目前唯一已知的H3K79甲基转移酶。MLL靶基因的启动子区域及基因区域高H3K79me2修饰在MLL重排白血病的发生、发展中起重要作用[22]–[23]。DOT1L基因失活可显著抑制MLL靶基因如HOXA9/MEIS1的表达并延缓白血病进程[23]–[28]。研究表明直接将DOT1L与MLL蛋白融合可激活HOXA家族基因的表达[27]。缺失DOT1L可导致MLL-AF9白血病细胞增殖受抑、分化增加、发生凋亡，提示DOT1L可能是治疗AML的潜在靶点[26]。

PRMT1是PRMT家族成员之一，负责调控组蛋白（H4R3me2a）及非组蛋白（如转录因子及剪切因子）的精氨酸位点甲基化。研究表明，PRMT1同样参与对MLL重排类白血病发生发展的调控[29]。MLL-EEN和MLL-GAS7以及非MLL重排类白血病融合蛋白MOZ-TIF2和AML1-ETO均需要PRMT1的募集[29]–[30]。在MLL重排类白血病以及MOZ-TIF2白血病中抑制PRMT1导致转录抑制并抑制白血病进程[30]。在MOZ-TIF2和MLL-GAS7白血病中，利用shRNA敲减PRMT1可降低H4R3me2a水平，并抑制HOXA9/MEIS1基因表达和白血病进程。此外，组蛋白H3K36甲基转移酶SETD2被证实在MLL重排白血病中发挥着重要的抑癌作用[31]。这些研究表明在包括MLL重排白血病的AML中，HMT对下游关键基因的调控在维持白血病进程起到重要作用。

二、组蛋白去甲基化酶（HDM，Eraser）的异常调控

甲基转移酶介导的特定位点甲基化可被相应的去甲基化酶去除。基于催化原理的不同，去甲基化酶可分为两类：一类是包括KDM1A和KDM1B在内的赖氨酸去甲基化酶（LSD），包含有黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）依赖的胺氧化酶，可去除me1和me2标记[32]。另一类是包含有JmjC结构域（JMJD），依赖于α-酮戊二酸将赖氨酸残基me1-3去除[33]。JMJD去甲基化酶包含多种家族蛋白，根据其保守结构域的不同可分为KDM2至KDM8[34]。

KDM在包括白血病在内的多种癌症中均呈现异常表达。LSD1是H3K4me1/2去甲基化酶，在MLL重排白血病中高表达，参与维持原癌基因的转录。利用shRNA敲减LSD1可减少MLL重排白血病的白血病干细胞（LSC）数目[35]。另一H3K4去甲基化酶KDM5B（针对H3K4me2/3位点）则负向调控MLL LSC的数目和功能[36]。在这一研究中，H3K4me 2/3对于维持MLL LSC十分重要，并伴随着细胞分化不断降低。抑制KDM5B可以显著促进疾病进程，而过表达KDM5B则可延缓MLL重排白血病。此外LSD1同时还参与了维甲酸受体（RARa）抑制髓系细胞分化的过程，而其中相关基因位点的H3K4me2水平呈显著下降[37]。这些结果表明，H3K4甲基化在MLL重排白血病和其他非MLL重排AML发病进展中均发挥作用。

除此之外，其他KDM包括KDM2B和JMJD1C同样参与调控了AML发病进程。H3K36me2去甲基化酶KDM2B调控p15基因沉默对于造血干祖细胞的体外恶性转化至关重要，敲除KDM2B可显著延缓HOXA9/MEIS1诱发的白血病进程，同时损伤LSC的自我更新功能[38]。H3K9去甲基化酶JMJD1C对于维持MLL-AF9白血病进程十分重要。敲除JMJD1C会抑制MLL-AF9白血病细胞增殖并促进白血病细胞凋亡[39]。JMJD1C同时还被报道参与AML1-ETO以及HOXA9介导的白血病进程[40]–[41]。此外还有研究表明，JMJD1C可作为AETFC的共激活因子参与组成AML1-ETO复合物，而JMJD1C则通过维持H3K9me2的低水平，从而激活AML1-ETO靶基因的表达。敲减JMJD1C可促使AML1-ETO白血病细胞分化并损伤细胞的克隆形成能力[40]。JMJD1C同时还可与HOXA9相互作用进一步调控下游LSC自我更新相关基因。缺失JMJD1C可抑制HOXA9诱发的白血病恶性转化，提示JMJD1C作为KDM家族中一员在维持AML疾病过程中起到重要调控作用[41]。

尽管以上研究表明HMT以及HDM在AML发病过程中的重要调控作用，然而其分子机制目前仍不明确。最近的研究表明，HMT与HDM之间存在的相互作用也许可以部分解释AML中组蛋白表观遗传修饰的调控机制。研究表明，DOT1L可阻断H3K9去乙酰化酶SIRT1以及H3K9甲基转移酶SUV39H1的相互作用[42]。抑制DOT1L后，SIRT1和SUV39H1可通过维持MLL靶基因Hoxa7/Meis1 H3K9me2高水平而保持异染色质状态。敲除SIRT1或SUV39H1后，会使得MLL-AF9白血病细胞对DOT1L抑制剂EPZ4777处理不敏感，而利用SIRT1激活剂SRT1720激活SIRT1后可提高DOT1L抑制剂的体内处理效果[42]。此外，研究表明，KDM4C可与PRTM1通过在MLL靶基因位点如HOXA9提高转录激活修饰H4R3me2a同时降低转录抑制修饰H3K9me3，从而共同调控AML发病进程。在小鼠模型中利用shRNA敲减PRMT1或KDM4C基因，均可使白血病小鼠发病延缓，同时降低下游MLL靶基因的表达水平，并延长小鼠生存期[30]。这表明两种表观遗传修饰酶对于MLL重排白血病的发病进程均起到重要的调控作用。

三、组蛋白修饰识别酶（Reader）的异常调控

最近对于表观遗传修饰在AML中的调控作用机制研究表明，靶向表观遗传修饰酶或许可以为临床治疗AML提供新的靶点。除了靶向组蛋白修饰的“Writer”和“Eraser”，靶向“Reader”也是一条有效抑制下游基因表达的途径。研究表明，MLL复合物中的一个重要组成蛋白WDR5，对于MLL蛋白的组蛋白甲基转移酶活性十分重要，可以帮助识别H3K4甲基化以及定位到K4位点帮助MLL蛋白进一步甲基化[36]。通过小分子抑制剂MM-401阻断MLL1-WDR5相互作用可特异性降低Hoxa基因位点的H3K4甲基化修饰，同时促进MLL-AF9小鼠白血病细胞分化并诱导白血病细胞凋亡[43]。除了WRD5家族，靶向识别赖氨酸乙酰化修饰的溴结构域蛋白（BRD）的研究也取得重要进展。最好例证就是靶向MLL重排白血病中的潜在靶点BRD家族蛋白。敲除BRD3/4或利用小分子抑制剂I-BET151（GSK1210151A）或JQ1均可抑制白血病细胞中Bcl-2、Myc和Cdk6的表达水平，在体内与体外均能够达到良好的抑制白血病效果[44]–[45]。这些研究表明靶向蛋白与蛋白的相互作用可能是有效的靶向治疗策略。BET家族蛋白是一类赖氨酸乙酰化修饰识别酶（Reader），可通过向下游靶基因启动子区域募集转录延伸因子（pTEFb）以及中介复合物（Mediator）从而进行促转录调控[46]。BET抑制剂无论是在体内还是体外实验中对于多种AML模型均具有良好的抑制白血病效果，因此BET抑制剂目前广泛进入了临床前期研究[47]。在一个Ⅰ期临床试验中，41例老年复发或难治性急性白血病患者（年龄≥60岁）口服BET抑制剂OTX015，其中2例患者获完全缓解，另外2例患者获部分缓解[48]。而使用BET抑制剂后常见的药物不良反应为腹泻和高胆红素血症。还有多项BET抑制剂进入临床试验，包括TEN-010（NCT02308761）、GSK525762（NCT01943851）和CPI-0610（NCT02158858）。BET抑制剂成为AML靶向治疗的潜在靶点，而目前进入Ⅰ期临床试验的抑制剂多为单独用药。因此，与传统治疗手段进行联合用药，或与新的其他靶向药物进行联合用药成为研究的热点。综上，进一步深入研究组蛋白修饰中“Writer”“Reader”“Eraser”的调控机制，将会为进一步提高AML的治疗效果带来希望。

四、组蛋白修饰作为临床治疗靶点研究现状

由于H3K79甲基化修饰在AML发病过程中的重要调控作用，目前针对DOT1L已有小分子抑制剂出现，其中第一代为EPZ4777，第二代为EPZ5676。这两种化合物均可对H3K79甲基化修饰选择性抑制并可抑制MLL重排类白血病细胞的增殖。通过体内给予DOT1L小分子抑制剂可显著延长MLL重排白血病小鼠生存期[49]–[50]。小鼠实验中良好的效果促成了第1例HMT抑制剂的临床试验。然而，DOT1L抑制剂因其药代动力学的不良特性极大地限制了临床试验的发展，同时这也可能部分解释临床初期效果不佳的原因。另一方面，PRMT1抑制剂AMI-408可显著延长MLL-GAS7或MOZ-TIF2小鼠模型生存期[30]。与DOT1L抑制剂类似，PRMT1小分子抑制剂对于白血病进程的抑制作用远不如基因敲除或shRNA干扰的效果，这表明这些小分子抑制剂的研发尚处于早期阶段，对于药物及其药代动力学性质的优化仍然有待于提升。有研究表明，在MLL-AF9小鼠模型中靶向H3K27甲基转移酶EZH2同样可延长小鼠生存期并减轻肿瘤负荷。体外细胞系实验表明，EZH2小分子抑制剂DZNep可通过重新激活TXNIP引起活性氧的聚集，从而诱发AML细胞凋亡[51]。在MLL-AF9小鼠模型中敲除EZH2或通过小分子抑制剂UNC1999抑制EZH1/2可提高PRC2靶基因如p16以及p19的表达水平[52]–[53]。GSK126通过靶向EZH/EED相互作用位点可在体外有效抑制MLL白血病细胞增殖，但抑制剂的体内效果还未被验证[54]。

此外，研究表明单胺氧化酶抑制剂（monoamine oxidase inhibitor）TCP单独或与全反式维甲酸结合使用可在体外有效抑制AML中LSD1活性[37]。与此同时，TCP衍生物GSK2879552已经进入Ⅰ期临床试验用于治疗复发后AML。然而，在临床前模型研究中，有效剂量的TCP表现出严重的毒性，因此TCP在临床应用中可能会产生广泛的尤其是针对中枢神经系统的毒性[55]。最近，出现了新的非一元胺氧化酶的抑制剂SP2509，与TCP相比具有相近的效果但毒副作用相对较低。SP2509与共抑制剂CoREST共同使用可抑制LSD1，从而促使下游基因如p21、p27和CCAAT/增强子结合蛋白的H3K4me3水平升高。SP2509可有效抑制携带有NPM1突变的AML细胞的克隆形成能力，并诱导细胞分化以及凋亡，但对MLL重排白血病细胞无明显效果[56]。同时，在小鼠异种移植模型中联合使用组蛋白去乙酰化转移酶抑制剂可有效延长白血病小鼠生存期[56]。值得注意的是，以上提到的表观遗传修饰靶点特别是DOT1L和LSD1对于正常的机体发育以及造血干细胞的维持都是必需的，这极大地限制了在患者中可使用的有效剂量，因此联合用药从而降低药物剂量成为新的研究方向（表1）。与之不同的是，KDM4C的小分子抑制剂SD70在临床前研究中对MOZ-TIF以及MLL重排类白血病均具有良好的效果[30]。这很可能由于KDM4C对于正常机体发育并非必需，在小鼠模型中KDM4C的完全敲除并无显著表型[30]。通过药理学方法抑制KDM4C可有效延长MLL白血病小鼠模型以及移植原代AML细胞的人源化小鼠模型的生存期。同时临床前研究表明，SD70对于动物模型具有较小的毒性，因此SD70极有希望成为AML治疗的潜在靶向药物。

表1. 血液肿瘤中靶向表观遗传修饰的临床研究现状.

蛋白	生物学功能	肿瘤类型	小分子抑制剂	临床试验	参考文献
DOT1L	H3K79甲基化	AML、ALL	EPZ-5676	NCT01684150	[49]
				NCT02141828
EZH2	H3K27	非霍奇金淋巴瘤	GSK2816126,	NCT01897571	[57]–[58]
	甲基化		EPZ-6438,	NCT02082977
			CPI-1205	NCT02395601
BET家族	赖氨酸乙酰化结合	AML、MDS、淋巴瘤、多发性骨髓瘤	OTOTX015	NCT01713582	[45],[59]–[60]
			CPI-0610	NCT01949883
				NCT02157636
				NCT02158858
				NCT02259114
				NCT02296476
				NCT02303782
LSD1	H3K4/K9	AML、MDS	GSK2879552	NCT02034123	[35],[37]
	去甲基化		tranylcypromine	NCT02177812
				NCT02261779
				NCT02273102
HDAC1/2/3	赖氨酸	T细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤	vorinstat	FDA已批准	[61]–[62]
	去乙酰化		romidepsin
			panobinostat

注：AML：急性髓系白血病；ALL：急性淋巴细胞白血病；MDS：骨髓增生异常综合征

五、展望

AML作为一类复杂的异质性疾病，常伴随有多种基因表达异常和表观遗传的异常修饰。尽管近年来对于AML发病的分子机制研究取得了很多进展，但是AML的治疗手段在过去几十年内并没有很大的变化。研发靶向AML中表观遗传异常修饰的化合物为AML的治疗提供了新的手段。单独应用靶向表观遗传修饰药物如BET抑制剂、LSD1抑制剂等已显现良好的治疗效果，而靶向表观遗传修饰药物同时联合传统治疗手段或其他靶向治疗方案有可能进一步提高AML的治疗效果。尽管距治愈AML任重而道远，但对AML中表观遗传修饰机制的深入研究将为靶向治疗AML提供更加有效的靶点。

Funding Statement

基金项目：国家自然科学基金（81421002、81629001、81470280、81600136）；中国医学科学院协和创新工程（2016-I2M-1-017、2017-I2M-3-015）；天津市科学技术委员会应用基础研究青年项目（17JCQNJC09800）