RNA腺苷脱氨酶在MLL-AF9诱导的小鼠急性髓系白血病发病中的作用

Abstract

目的

建立敲除RNA腺苷脱氨酶1(ADAR1)的小鼠MLL-AF9融合基因急性髓系白血病（AML）模型，初步探讨ADAR1对AML发病的影响。

方法

采用免疫磁珠法富集介导雌激素受体-重组酶Cre (ER-Cre)的ADAR1^lox/lox及其对照ADAR1^lox/lox小鼠骨髓Lineage⁻（Lin⁻）细胞，用携带MSCVMLL/AF9-IRES-GFP的逆转录病毒感染上述Lin⁻细胞，流式细胞术检测感染效率，移植相同数量细胞至致死剂量和半致死剂量照射受体小鼠中，建立MLL-AF9诱导的AML模型。移植48 h后诱导ADAR1敲除，体内实验分为实验组（ER-Cre;ADAR1^lox/lox＋他莫昔芬）和对照组(①ER-Cre;ADAR1^lox/lox +空载体、②ADAR1^lox/lox+他莫昔芬、③ADAR1^lox/lox＋空载体)，第10、15、20天分别检测小鼠外周血GFP⁺细胞比例，观察各组小鼠的存活情况。体外实验分组同上，将他莫昔芬改为4-羟基他莫昔芬，观察各组AML细胞并检测其凋亡情况。

结果

成功建立敲除ADAR1的MLL-AF9融合基因AML小鼠模型。与对照组比较，体内实验中实验组AML小鼠在各时间点外周血GFP⁺细胞比例均降低，存活时间明显延长，差异均有统计学意义(P值均<0.05)；体外实验中实验组细胞总数、GFP⁺细胞比例均降低，Annexin Ⅴ⁺7-AAD⁺和Annexin Ⅴ⁺细胞比例均升高，差异均有统计学意义(P值均<0.05)。

结论

敲除ADAR1可减缓AML的发病，增加AML细胞凋亡。ADAR1在MLL-AF9诱导的AML发生和维持过程中起关键作用。

RNA腺苷脱氨酶1 (Adenosine deaminase that act on RNA 1，ADAR1)是一种双链RNA编辑酶，能够实现对转录后RNA A-to-I的编辑。前期的研究发现，ADAR1在造血系统调节中起到重要的作用，敲除ADAR1会引起造血祖细胞分化受阻并发生凋亡[1]，在儿童急性白血病及小鼠急性T淋巴细胞白血病模型中发现ADAR1的两种同工型蛋白P110和P150表达异常[2]–[3]。另外，有文献报道在慢性髓性白血病细胞中敲除ADAR1会造成白血病细胞的显著减少[4]。这些研究表明ADAR1对正常造血以及血液系统疾病的发生至关重要，但是目前ADAR1在急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）中的作用还不清楚。在本研究中我们采用可诱导全身敲除ADAR1的雌激素受体-重组酶Cre (ER-Cre) ; ADAR1^lox/lox小鼠，建立小鼠混合谱系白血病（mixed lineage leukemia，MLL)-AF9融合基因AML小鼠模型，并在体内、外敲除ADAR1以观察其对AML发病的影响。

材料和方法

1．主要材料和试剂：B6.Cg-Tg（CAG-cre/Esr1）5Amc/J（ER-Cre）小鼠和ADAR1^lox/lox小鼠购自美国Jackson实验室，C57BL/6J（B6）小鼠来自本所实验动物中心，所有小鼠均饲养于SPF级动物室；293 T细胞、MSCV-MLL/AF9-IRES-GFP、pKat及pCMV-VSVG由本实验室保存；Opti-MEM培养基购自美国Gibco公司；多聚季铵盐、他莫昔芬、4-羟基他莫昔芬及玉米油购自美国Sigma-Aldrich公司；Lipofectamine2000购自美国Invitrogen公司；纤维连接蛋白购自日本TaKaRa公司；重组小鼠干细胞生长因子（mSCF)、重组小鼠白细胞介素-3 (mIL-3)及重组小鼠白细胞介素-6 (mIL-6)均购自美国PeproTech公司；DNA提取试剂盒购自德国Qiagen公司；PCR试剂购自北京全式金生物技术有限公司；Lin⁻磁珠抗体购自德国美天旎生物技术有限公司；流式细胞仪及其相关抗体购自美国BD Bioscience公司。

2．PCR法检测ADAR1基因表达：①鉴定小鼠基因型：ER-Cre; ADAR1^lox/lox小鼠基因结构模式图见图1，小鼠出生后3周左右，剪取0.3~0.5 cm鼠尾置于1.5 ml离心管中，加入300 µl鼠尾裂解液55 °C裂解过夜，再将裂解液80 °C失活10 min。离心后行PCR检测。引物序列见表1，反应条件：95 °C预变性2 min，95 °C变性30 s, 57 °C退火30 s, 72 °C延伸30 s，共35个循环。反应结束后，取7 µl扩增产物行15 g/L的琼脂糖凝胶电泳，最后用凝胶成像系统拍照。②检测ADAR1在其基因组中的敲除情况：连续5 d对ER-Cre; ADAR1^lox/lox小鼠用他莫昔芬或玉米油空载体进行腹腔注射，之后取小鼠骨髓细胞用PCR法检测ADAR1在其基因组中的敲除情况，反应条件同上。所用引物为图1中所示的引物P1和P3，如果敲除了ADAR1的第12到15个外显子，通过引物P1和P3就能够扩增出大小为500 bp的特异性片段，如果没有敲除，则会得到一系列的非特异性片段。

图1. ER-Cre;ADAR1^lox/lox小鼠基因结构模式图（E：外显子，P：引物）.

表1. PCR扩增引物序列.

引物	序列(5′→ 3′方向)
Cre上游引物	GCGGTCTGGCAGTAAAAACTATC
Cre下游引物	GTGAAACAGCATTGCTGTCACTT
7338	CTAGGCCACAGAATTGAAAGATCT
7339	GTAGGTGGAAATTCTAGCATCATCC
P 1	CGGGATCCCCAAGGTGGAGAATGGTGAGTGGTA
P 2	GCTCTAGAAGAGGGCACAGCCACAGCAGGAC
P 3	GCTCTAGAGAATCAAACCCACAAGAGGCCAGTG

注：P1: LoxP引物1; P2: LoxP引物2; P3: LoxP引物3

3．Western blot法检测ADAR1蛋白表达：收集5×10⁶个细胞，裂解细胞后提取蛋白上清，取100 µg蛋白上清行80 g/L SDS-PAGE，用半干转膜的方法将蛋白转移至硝酸纤维膜，加入兔抗小鼠ADAR1抗体和GAPDH抗体4 °C过夜后加入羊抗兔二抗孵育，TBS-T漂洗3次，每次5 min，加入显色剂后显影，检测ADAR1蛋白表达。

4．包装逆转录病毒：脂质体Lipofectamine2000共转染MSCV-MLL/AF9-IRES-GFP、pKat、VSVG至293 T细胞，48、72 h后可分别在荧光显微镜下观察到绿色荧光，收集病毒上清过滤后−80 °C冻存备用。

5．免疫磁珠法富集小鼠骨髓Lin⁻细胞：取6~8周ER-Cre;ADAR1^lox/lox及ADAR1^lox/lox小鼠，颈椎脱臼法处死后，取其双下肢分离股骨、胫骨和胯骨，常规分离和收集骨髓单个核细胞（MNC）。将1×10⁸个MNC过LS磁柱（内部充填Lin⁻磁珠），收集Lin⁻细胞。

6．逆转录病毒感染小鼠骨髓Lin⁻细胞：将富集的Lin⁻细胞用IMDM（含15%FBS、50 ng/ml mSCF、10 ng/ml mIL-3、10 ng/ml mIL-6）培养液培养6~8 h后转入用纤维连接蛋白处理过的24孔板中，细胞密度为5×10⁵/ml，加入病毒上清、6 µg/ml多聚季铵盐，450×g离心90 min，置于37 °C，5% CO₂孵箱中培养8~10 h，换新鲜培养基培养48 h。收集感染过的细胞置于荧光显微镜下观察病毒感染情况。

7．小鼠移植实验：P₀代受体小鼠用X射线放射源照射2次（4.75 Gy／次，剂量率为1.25 Gy/min），每次照射间隔4 h，照射完毕4 h后其作为受体小鼠可进行移植实验。采用流式细胞分选术分选感染成功的GFP⁺细胞，取5×10⁵个GFP⁺细胞和2×10⁵个ADAR1^lox/lox小鼠骨髓细胞（保护细胞）通过尾静脉注射移植至受体小鼠内，移植后给予抗生素预防感染。P₁~P₃代受体小鼠只接受4.75 Gy照射1次，后续实验与P₀代移植类似。实验流程如图2所示。

图2. 建立MLL-AF9诱导的急性髓系白血病小鼠模型实验流程图.

8．流式细胞术检测小鼠骨髓和脾脏中GFP⁺细胞数量及表型：取受体小鼠外周血、骨髓或脾脏中单个核细胞，每5×10⁵个细胞加入CD3-PE、B220-PerCP-Cy5.5、Mac-1-APC、Gr-1-PE-Cy7各1 µl冰上孵育30 min，PBS洗涤1次，PBS重悬样本，过膜后，上流式细胞仪进行分析。每次实验设3个复孔，实验重复3次。

9．他莫昔芬诱导Cre表达：

体内诱导实验：实验分为实验组（ER-Cre; ADAR1^lox/lox＋他莫昔芬）和对照组（①ER-Cre; ADAR1^lox/lox＋空载体、②ADAR1^lox/lox＋他莫昔芬、③ADAR1^lox/lox＋空载体）。ER-Cre;ADAR1^lox/lox小鼠和ADAR1^lox/lox小鼠在均给予他莫昔芬和玉米油（空载体对照）处理的条件下，只有ER-Cre;ADAR1^lox/lox小鼠可以敲除ADAR1故作为实验组，其余三组不能敲除ADAR1故作为对照组。将他莫昔芬溶解于玉米油中，浓度为25 mg/ml，各组小鼠分别以150 mg·kg⁻¹·d⁻¹他莫昔芬或相同剂量玉米油连续5 d腹腔注射处理。第10、15、20天分别检测小鼠外周血GFP⁺细胞比例，观察各组小鼠的存活情况。各组鼠数为3只。

体外诱导实验：体外诱导实验分组同上，将他莫昔芬改为4-羟基他莫昔芬。将4-羟基他莫昔芬粉末溶解于无水乙醇中，储存液浓度为20 mg/ml。将移植后发病的P₃代小鼠骨髓细胞取出，5×10⁵个细胞置于IMDM+10% FBS（SCF/IL-3/IL-6）培养基中培养，各组分别加入2.5 µmol/L 4-羟基他莫昔芬或相同剂量无水乙醇（空载体对照）处理。采用流式细胞术检测各组AML细胞总数、GFP⁺细胞比例、Annexin Ⅴ⁺7-AAD⁺和Annexin Ⅴ⁺细胞比例。每次实验设3个复孔，实验重复3次。

10．统计学处理：采用SPSS 10.0软件进行统计学分析。所有数据均采用均数±标准差表示。两组独立样本之间差异的比较采用配对t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1．他莫昔芬对ADAR1表达的影响：用他莫昔芬处理ER-Cre;ADAR1^lox/lox小鼠后，PCR法检查结果显示小鼠骨髓细胞ADAR1的第12到15个外显子可被有效敲除（图3A）。Western blot法检测结果显示，小鼠骨髓细胞ADAR1蛋白表达水平较对照组明显减少（图3B）。

图3. PCR法（A）及Western blot法（B）检测他莫昔芬对ADAR1表达的影响.

M：Marker；Cre：Cre酶cDNA扩增片段；lox1/2：P1/P2间cDNA扩增片段；lox1/3：P1/P3间cDNA扩增片段

2．成功构建可诱导敲除ADAR1的小鼠MLL-AF9白血病模型：首先包装携带MSCV-MLL/AF9-IRES-GFP的逆转录病毒，293 T细胞形态由梭型变成饱满的球型并融汇聚集形成一片，荧光显微镜下可见视野中大片绿荧光（图4A、B），表明其正在产生病毒；之后用产生的逆转录病毒分别感染ER-Cre；ADAR1^lox/lox小鼠和ADAR1^lox/lox小鼠骨髓Lin⁻细胞（图4C、D）。随后分选GFP⁺细胞并移植至致死剂量照射的P₀代受体小鼠中。受体小鼠以外周血中GFP⁺细胞比例大于30%、小鼠出现白血病发病症状、解剖发现脾增大为发病标准。结果显示P₀代受体小鼠在移植后50~70 d全部死亡，发病期间出现行动迟缓、弓背、竖毛等症状，濒死前解剖可见脾脏较野生对照组明显增大（图5)；外周血白细胞计数为（6.8±0.9)×10¹⁰/L，较对照组小鼠[(2.0±0.2)× 10¹⁰/L]明显增高，差异有统计学意义(P<0.05)；骨髓和脾脏中GFP⁺细胞数大于70 %，且这群GFP⁺细胞高表达髓系标识Mac-1和Gr-1，不表达B细胞标识B220和T细胞标识CD3(图6)，符合MLL-AF9白血病的发病特征。

图4. 包装逆转录病毒及用产生的病毒感染Lin⁻细胞（×200）.

A、B：包装携带MSCV-MLL/AF9-IRES-GFP 逆转录病毒的293 T 细胞；C、D：逆转录病毒感染Lin-细胞

图5. 构建可诱导敲除ADAR1的MLL-AF9急性髓系白血病小鼠模型与野生对照小鼠脾脏比较.

图6. 流式细胞术检测构建可诱导敲除ADAR1的MLL-AF9急性髓系白血病小鼠模型GFP⁺细胞表型.

3．体内敲除ADAR1对MLL-AF9白血病小鼠发病的影响：他莫昔芬处理后ER-Cre；ADAR1^lox/lox AML受体小鼠在各时间点外周血中GFP⁺细胞比例均低于其他对照组，其存活时间与对照组相比明显延长，差异均有统计学意义（P值均< 0.05）（图7）。

图7. 体内敲除ADAR1对MLL-AF9白血病小鼠发病的影响.

A：各组小鼠外周血中GFP+细胞比例比较；B：各组小鼠生存曲线比较；与实验组（ER-Cre;ADAR1lox/lox+他莫昔芬）比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

4．体外敲除ADAR1对AML细胞增殖、凋亡的影响：移植后发病的P₃代小鼠骨髓细胞开始培养时，ER-Cre;ADAR1^lox/lox组GFP⁺细胞比例为64%，ADAR1^lox/lox组为60%。每组分别用4-羟基他莫昔芬及相同剂量乙醇处理后，实验组细胞总数、GFP⁺细胞比例均较对照组降低，Annexin Ⅴ⁺ 7-AAD⁺和Annexin Ⅴ⁺细胞比例均升高，差异均有统计学意义（P值均<0.05）（表2）。

表2. 流式细胞术检测4-羟基他莫昔芬（4-HTAM）处理48 h后对细胞增殖和凋亡的影响（x±s）.

组别	细胞总数(×105)		GFP+细胞比例(％)		AnnexinⅤ+7-AAD+细胞比例(％)	Annexin Ⅴ +细胞比例(％)
	0 h	48 h	0 h	48 h
ER-Cre;ADAR1lox/lox+4-HTAM	5.0	5.2±0.9	64	48.0±0.6a	32.2±2.5	56.2±4.1
ER-Cre;ADAR1lox-lox+乙醇空载体	5.0	10.8±0.4a	64	65.5±1.7b	12.6±0.8d	27.3±2.2d
ADAR1lox/lox+4-HTAM	5.0	8.5±0.4a	60	62.7±0.6b	22.4±2.2e	43.9±4.9f
DAR1lox/lox+乙醇空载体	5.0	11.0±0.5a	60	66.9±7.4c	12.4±0.7d	26.7±1.1d

注：与0 h组比较，^aP<0.001，^bP<0.01，^cP<0.05；与ER-Cre;ADAR1^lox/lox+4-HTAM组比较，^dP<0.001，^eP<0.01，^fP<0.05

讨论

ADAR1最早是作为一种RNA编辑酶被发现并命名的，它能够将转录后形成的双链RNA上的腺嘌呤脱氨基变成次黄嘌呤，完成碱基A到I的转换。ADAR1的RNA编辑作用可以影响RNA的结构、稳定性及其剪接作用，并且可导致多种同工型蛋白的产生[5]–[6]。另外，ADAR1可不依赖其编辑活性发挥作用，它能通过影响胞质内其他双链RNA结合蛋白的活性改变细胞功能[7]–[8]。

Cre/lox重组系统须包括Cre重组酶和lox位点两个要素，Cre重组酶才能特异识别并催化两个lox位点之间的片段进行重组。我们在前期研究中建立了lox位点锚定ADAR1基因催化结构域的ADAR1^lox/lox小鼠，在本项研究中我们首次将ER-Cre小鼠与ADAR1^lox/lox小鼠交配，成功得到了ER-Cre;ADAR1^lox/lox小鼠（结果在本文中未显示）。ER-Cre;ADAR1^lox/lox小鼠是将经过突变改造的ER的配体结合区置于Cre前，ER在结合雌激素类似物4-羟基他莫昔芬后能够诱导重组酶Cre的表达，敲除两个lox位点之间的片段，最终介导ER-Cre; ADAR1^lox/lox小鼠中ADAR1的敲除。其通过腹腔注射他莫昔芬或体外采用4-羟基他莫昔芬处理，可诱导ADAR1从基因组中敲除，因此它可以作为研究ADAR1的工具小鼠。而他莫昔芬体外溶解性差，但溶于玉米油，在体内经肝脏代谢后可以转化为其活化形式4-羟基他莫昔芬发挥功能，因此常用于腹腔注射的方式使用[9]，而4-羟基他莫昔芬溶于乙醇且体外稳定性好，常用于体外实验[10]。

MLL基因相关白血病在临床上多数恶性程度高、预后不良且常易复发的特点，因此其研究结果具有非常重要的意义。MLL基因常可与多种基因发生融合，而MLL融合基因能使祖细胞获得干细胞特性，诱发白血病。其中80％的MLL基因相关白血病由MLL-AF4、MLL-AF9、MLL-ENL、MLL-AF10及MLL-AF6这五种最常见的融合基因所导致[11]。近几年，利用逆转录病毒诱导构建小鼠白血病模型的方法具有发病周期短，可移植传代及诱导效率高等特点[12]，尤其是构建的MLL-AF9融合基因小鼠模型。在本实验中，我们通过用携带MLL-AF9融合基因的逆转录病毒感染小鼠骨髓的Lin⁻细胞，体外检测后，将被感染的Lin⁻细胞移植入致死剂量照射或半致死剂量照射的小鼠体内，建立白血病模型，结果显示可100％诱导发病且形成AML。

在本实验中，我们首先利用ER-Cre;ADAR1^lox/lox小鼠建立了MLL-AF9诱导的AML模型，应用此模型可以获得大量的AML细胞，并且能将ADAR1在小鼠体内外分别诱导敲除以研究对AML发病的影响。体内试验结果表明，敲除ADAR1后显示白血病进展的GFP⁺细胞比例在各监测时间点低于对照组，敲除组小鼠的存活时间也较对照组延长。体外实验进一步证明敲除组的AML细胞在培养基中培养48 h后，细胞总数没有增加，GFP⁺细胞比例及总数均低于对照组，且GFP⁺细胞凋亡比例显著高于对照组。以上研究结果显示ADAR1对于MLL-AF9诱导的AML细胞的发生和维持起关键作用。

目前，体内研究得出比较明确结论的几个ADAR1作用底物大多是神经转移受体和离子通道受体的mRNA[13]–[15]，而ADAR1在AML细胞及造血细胞中的作用底物至今没有相关报道。我们的实验结果说明MLL-AF9诱导的AML发生过程中需要ADAR1，因此ADAR1可能成为一种潜在的治疗AML的药物靶点。进一步研究ADAR1在AML中的作用靶点，揭示其对于AML作用的分子机制，从而开发可以作用于ADAR1的小分子药物，可能为临床治疗AML提供新的方向。

Funding Statement

基金项目：科技部国家973项目（2012CB966601、2013BAI01B09）；国家自然科学基金（81090413、81470280、81328003）