艾滋病相关淋巴瘤（AIDS related lymphoma, ARL）是指与HIV感染有关、伴有严重获得性免疫缺陷的淋巴组织恶性肿瘤，包括霍奇金淋巴瘤（HIV-HL）和非霍奇金淋巴瘤(HIV-NHL)。有研究者发现虽然伴随高效抗逆转录病毒治疗（HAART）的广泛应用，HIV的感染率得到有效控制，但由于AIDS患者病死率的明显下降和生存期的延长，ARL的发病率并未出现明显减少[1]–[2]。ARL已取代Kaposi肉瘤成为与AIDS相关的最常见的恶性肿瘤[3]–[4]。ARL可发生在任何HIV感染情况下，包括儿童患者。据推测，ARL发生率是普通人群的60~200倍[5]–[6]。ARL在病理分型上90％以上以B细胞来源的淋巴瘤为主，其中80%~90％为弥漫大B细胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma, DLBCL)[7]–[8]。HIV-DLBCL患者多在临床免疫缺陷进展期发病，其病程进展快，预后差，其发生、发展的分子机制尚不清楚。研究表明，miRNA在多种肿瘤发生、发展的过程中发挥作用，其差异表达可作为肿瘤患者诊断和预后的指标及治疗的新靶点[9]。在本研究中我们采用miRNA芯片技术研究HIV-DLBCL和non-HIVDLBCL患者组织中miRNA表达谱的差异，旨在从分子水平对HIV-DLBCL的发病机制进行初步探讨。
病例和方法
1．病例：
以2010年12月至2013年2月云南省多家医院确诊的6例HIV-DLBCL患者的手术后石蜡包埋病理标本为实验组（exp1~6)，以4例non-HIV-DLBCL患者标本为对照组（con1~4)。10例患者一般临床特征见表1。
表1. 10例HIV感染相关性弥漫大B细胞淋巴瘤(HIV-DLBCL)患者一般临床特征.
| 例号 | 年龄(岁） | 性别 | 术前诊断 | 取材部位 |
| 1 | 41 | 女 | HIV-DLBCL | 右腹股沟淋巴结 |
| 2 | 30 | 女 | HIV-DLBCL | 腹股沟淋巴结 |
| 3 | 35 | 女 | HIV-DLBCL | 结肠系膜淋巴结 |
| 4 | 39 | 女 | HIV-DLBCL | 右颈部淋巴结 |
| 5 | 40 | 女 | HIV-DLBCL | 左侧睾丸肿瘤 |
| 6 | 37 | 男 | HIV-DLBCL | 左侧颈部淋巴结 |
| 7 | 42 | 男 | DLBCL | 右大腿根部包块 |
| 8 | 59 | 男 | DLBCL | 右颈部淋巴结 |
| 9 | 27 | 男 | DLBCL | 左锁骨上淋巴结 |
| 10 | 72 | 女 | DLBCL | 后腹膜淋巴结 |
2．石蜡包埋病理标本处理：EP管经0.1％焦碳酸二乙酯(DEPC）水浸泡过夜后，高温高压灭活DEPC。制备厚度为8 µm的石蜡组织切片8~10张，置于EP管中保存。
3．组织总RNA提取及质量检测：将石蜡组织标本进行脱蜡处理后，采用TRIzol法（试剂为美国Invitrogen life Technologies公司产品）提取总RNA，异丙醇沉淀法浓缩RNA，采用紫外分光光度计（美国Nanodrop ND1000公司产品）测定RNA的浓度和纯度，琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA的完整性。
4．miRNA芯片技术检测患者组织中miRNA表达谱：按照miRCURY™ Hy3™荧光标记试剂盒（丹麦Exiqon公司产品）说明书进行操作，利用T4 RNA连接酶对分离得到的RNA样品进行Hy3荧光标记。将标记好的miRNA与miRCURY™ LNA Array (v.18.0）芯片（丹麦Exiqon公司产品）进行杂交。每一样本使用一张芯片，同一样本在每张芯片上重复4次检测。杂交后芯片采用试剂盒自带缓冲液进行洗片后甩干。采用美国Axon公司的GenePix 4000B芯片扫描仪对杂交后芯片进行图像扫描，采用GenePix pro 6.0软件进行原始数据分析。每个探针的绿色信号强度经过去背景化后，将4个重复探针取平均值，并用中位数标准化方法对获得的数据进行标准化处理，标准值＝（原始值−背景值）／中位数；选取实验中芯片修正值（原始值−背景值）均≥30的非对照探针的中位数作为标准化因子，对整张芯片的点进行标准化处理。经过标准化后，通过t检验方法分析出差异表达的miRNA。HIV-DLBCL与non-HIV-DLBCL患者组织表达水平比值>2或<0.5即可认为存在显著性上调或下调趋势。最后使用MeV软件进行聚类分析。miRNA芯片杂交及数据分析均由上海康成生物工程有限公司完成。
5．靶基因预测：应用生物信息学软件（MiRanda、miRBase Targets、TargetScan）进行差异表达miRNA的靶基因预测，取至少2个软件以上预测得到的交集基因作为靶基因。同时结合KEGG (Kyoto Encyclopedia of Gens and Genome）数据库分析交集靶基因参与的信号转导通路，进一步筛选出与免疫缺陷及HIV感染相关的靶基因。
结果
1．各标本的总RNA纯度和质量鉴定情况：紫外分光光度计检测的结果显示，两组样本的吸光度(A)260/A280值均在1.8~2.1之间。琼脂糖凝胶电泳结果显示样本28 s、18 s rRNA两条带清晰，未见明显DNA和蛋白质污染，表明各样本RNA质量合格，符合miRNA芯片检测的要求。
2．芯片杂交质量及样品性质比较：相关系数R(Correlation coefficient R-value）表明重复样本之间相关性的高低或者是不同组的样本间的差别大小，重复性越好R值越大，差异越大R值越小。两样本差异越大，其散点图距离X=Y这条直线越远，分散程度越大。结果显示实验组与对照组患者标本的杂交信号相关性较低，但组内相关性较高（表2、3）。
表2. HIV感染相关性弥漫大B细胞淋巴瘤患者miRNA芯片间相关系数R矩阵表.
| 标本编号 | exp1 | exp2 | exp3 | exp4 | exp5 | exp6 |
| exp1 | 1 | 0.971 | 0.742 | 0.921 | 0.697 | 0.952 |
| exp2 | 1 | 0.792 | 0.924 | 0.751 | 0.934 | |
| exp3 | 1 | 0.831 | 0.979 | 0.777 | ||
| exp4 | 1 | 0.754 | 0.969 | |||
| exp5 | 1 | 0.712 | ||||
| exp6 | 1 |
注：exp：实验组
表3. 非HIV感染相关性弥漫大B细胞淋巴瘤患者miRNA芯片间相关系数R矩阵表.
| 标本编号 | con1 | con2 | con3 | con4 |
| con1 | 1 | 0.810 | 0.713 | 0.942 |
| con2 | 1 | 0.971 | 0.898 | |
| con3 | 1 | 0.819 | ||
| con4 | 1 |
注：con：对照组
3．HIV-DLBCL与non-HIV-DLBCL患者组织中差异表达的miRNA：采用含有3 100个捕获探针的芯片对样本进行检测，芯片杂交后扫描图像显示，所有芯片信号和背景清晰，扫描软件显示信噪比高。使用Hy3™单色荧光基团标记，光点清晰，可重复性好。数据分析结果显示共得到108个表达差异大于2倍的miRNA，其中HIV-DLBCL患者组织中表达增高的miRNA有64个，表达降低的miRNA有44个。经t检验筛选出23个与HIV-DLBCL相关的miRNA，其中上调的miRNA有6个，下调的miRNA有17个（表4）。
表4. 23个与HIV感染相关性弥漫大B细胞淋巴瘤相关的miRNA.
| miRNA名称 | 倍性变化比值 | P值 |
| 上调miRNA | ||
| ebv-miR-BART8-5p | 248.155 | 0.001 |
| miR-185-3p | 3.016 | 0.032 |
| miR-1469 | 2.413 | 0.046 |
| miR-744-5p | 2.402 | 0.029 |
| miR-4505 | 2.079 | 0.030 |
| miR-4497 | 2.391 | 0.038 |
| 下调miRNA | ||
| miR-664a-5p | 0.197 | 0.006 |
| miR-502-3p | 0.245 | 0.036 |
| miR-660-5p | 0.258 | 0.039 |
| miR-96-5p | 0.349 | 0.004 |
| miR-29a-5p | 0.421 | 0.001 |
| miR-182-5p | 0.422 | 0.009 |
| miR-769-5p | 0.447 | 0.022 |
| miR-129-2-3p | 0.446 | 0.008 |
| miR-532-5p | 0.253 | 0.038 |
| miR-664b-5p | 0.419 | 0.016 |
| miR-320a | 0.402 | 0.029 |
| miR-891a-5p | 0.478 | 0.041 |
| miR-30b-5p | 0.337 | 0.012 |
| miR-30d-5p | 0.360 | 0.008 |
| miR-3607-3p | 0.384 | 0.014 |
| miR-3653 | 0.161 | 0.047 |
| miR-32-3p | 0.465 | 0.044 |
4．靶基因预测：结果显示筛选出4个与免疫缺陷相关的miRNA靶基因，分别为受miR-185-3p靶向调节的T细胞受体Zeta链相关蛋白激酶（ZAP70)、肿瘤坏死因子受体超家族成员13 c (TNFRSF13C)、免疫球蛋白lambda样多肽1(IGLL1）和受miR-744-5p靶向调节的CD79A。
讨论
近年研究表明，miRNA作为生物体内一种重要的基因调控分子，与多种人类肿瘤密切相关。在已发现的人类miRNA中，50％以上定位于染色体上与肿瘤发生相关的脆性位点[10]。一种miRNA具有多个蛋白表达调控靶点，一个基因也可能受多种miRNA的共同作用，因此miRNA的整体调控网络极其复杂。目前，miRNA表达谱已成为肿瘤学研究的热点。各种类型或不同组织来源的肿瘤都具有各自特殊的miRNA表达模式，提示肿瘤的miRNA表达谱可能具有特异性[11]–[12]。筛选不同肿瘤中差异表达的miRNA及靶基因，明确其作用机制，将为肿瘤诊断、治疗和预后提供新的突破口。在免疫缺陷基础上发生的肿瘤，尤其是淋巴瘤，在发病机制、遗传学、免疫表型和临床表现等方面均可能不同于免疫功能正常的同类肿瘤，因此，对ARL的miRNA表达谱的研究具有重要意义。
在本研究中我们采用miRNA芯片技术对比HIVDLBCL和non-HIV-DLBCL患者组织的miRNA表达谱，共筛选出23个表达存在显著性差异的miRNA，其中在HIVDLBCL患者组织中上调的miRNA有6个，下调的miRNA有17个。通过分析，进一步筛选出4个与免疫缺陷相关的miRNA靶基因，分别为受miR-185-3p靶向调节的ZAP70、TNFRSF13C、IGLL1以及受miR-744-5p靶向调节的CD79A。我们的研究结果提示miR-185-3p和miR-744-5p很可能参与调控HIV的感染和HIV-DLBCL患者的疾病进展过程，有望成为HIV-DLBCL的分子标志物。
已有研究证实miR-185和miR-744的表达上调均能促进部分肿瘤的发生、发展。Akçakaya等[13]发现miR-185的高表达与结肠癌患者肿瘤细胞转移和疾病、复发呈正相关，而与其生存时间呈负相关。Song等[14]采用实时定量PCR筛选胃癌患者和正常人群血清中表达水平具有差异的miRNA，证实miR-744在早期胃癌患者血清中水平上调，且在胃癌的进展过程中也继续呈现增长趋势。在本研究中我们筛选出的miR-185-3p和miR-744-5p在HIV-DLBCL患者组织中表达均较non-HIV-DLBCL组织上调2倍以上，推测很可能与加速HIV-DLBCL患者的病程进展有关。
人体感染HIV后，CD4+ T淋巴细胞受HIV病毒攻击，数量不断减少，发生机会感染和恶性肿瘤的概率大大增加。研究证实HIV合并恶性肿瘤患者的CD4+ T淋巴细胞数显著低于非HIV恶性肿瘤患者，提示免疫力下降是HIV合并恶性肿瘤的关键因素之一。非HIV人群和HIV感染人群常见恶性肿瘤的差异可能与HIV/AIDS患者细胞免疫功能下降、易发生多种致瘤病毒持续感染有关[15]。
根据信号通路分析结果，我们发现ZAP70、TNFRSF13C、IGLL1和CD79A与HIV-DLBCL患者的免疫缺陷相关，可导致机体抗感染能力、免疫功能、免疫监控能力下降，引发各种病症。ZAP70是一种酪氨酸激酶，广泛表达于T细胞和NK细胞中，ZAP70的缺失或突变均可导致重症联合免疫缺陷病[16]–[17]。B淋巴细胞活化因子（BAFF）是肿瘤坏死因子超家族成员之一，在B淋巴细胞生长、分化、发育及自身免疫性疾病中具有重要作用，而TNFRSF13C是BAFF的一种细胞表面受体（BAFF-R)，BAFF和BAFF-R缺陷小鼠的免疫反应严重减弱，而在多种自身免疫性疾病小鼠模型体内应用BAFF的可溶性诱饵受体，可以有效减缓疾病的进程[18]。X连锁无丙种球蛋白血症是由人类B细胞发育障碍引起的原发性免疫缺陷病，存在包括IGLL1和CD79A在内的多基因缺陷[19]。此外，Capello等[20]在免疫缺陷相关的NHL中也发现了CD79A的突变。通过靶基因分析，我们推测miR-185-3p和miR-744-5p的上调将抑制靶基因ZAP70、TNFRSF13C、IGLL1和CD79A的表达，导致免疫缺陷，增强机体对HIV的易感性和HIV-DLBCL的发生率。
综上所述，在本研究中我们采用芯片技术，对HIVDLBCL和non-HIV-DLBCL患者组织的miRNA表达谱进行初步研究，与后者比较，前者存在一系列上调和下调的miRNA；靶基因预测及功能分析提示miR-185-3p和miR-744-5p可能通过调控ZAP70、TNFRSF13C、IGLL1、CD79A参与HIV-DLBCL的发生、发展。在后续研究中，我们将在大量样本中验证差异表达的miRNA在HIV-DLBCL中的生物学功能及其靶基因的效应。
Funding Statement
基金项目：国家自然科学基金（81060191）
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