流式细胞术检测伊红-5′-马来酰亚胺标记红细胞在80例遗传性球形红细胞增多症中的诊断价值

Abstract

目的

探讨伊红-5′-马来酰亚胺（EMA）为标记流式细胞术检测遗传性球形红细胞的灵敏性和特异性，并对试剂和样本稳定性进行验证。

方法

对80例遗传性球形红细胞增多症（HS）和44例非HS患者外周血样本全部采用EMA标记流式细胞术检测、红细胞渗透脆性试验和酸化甘油溶解试验三种方法进行检测，比较三种方法的灵敏性和特异性，探讨EMA标记流式细胞术检测的可行性。并观察EMA及样本在不同储存条件下的稳定性。

结果

通过检测124例样本得出，EMA标记流式细胞术检测的灵敏性和特异性分别为0.925和0.954，红细胞渗透脆性试验分别为0.950和0.455，酸化甘油溶解试验为1.000和0.318。红细胞渗透脆性试验和酸化甘油溶解试验的灵敏性稍高于EMA流式检测方法，但特异性差，不能明确区分球形红细胞增多是否为HS。EMA对温度很敏感，−80 °C储存180 d较4 °C存储1 d稳定。HS样本的稳定性较好，4 °C放置6 d、室温条件放置3 d不会影响结果的判定。

结论

EMA标记流式细胞术检测HS具有良好的灵敏性和特异性，−80 °C储存EMA较为稳定，须在样本4 °C放置6 d内、室温条件放置3 d内完成检测。

遗传性球形红细胞增多症（HS）是一种红细胞膜异常的遗传性溶血性疾病，这类球形红细胞以α-血影蛋白、β-血影蛋白、锚蛋白、带3蛋白、蛋白4.1和蛋白4.2等膜骨架蛋白异常为主[1]，通过脾脏时极易发生溶血，溶血程度差异很大。目前，实验室诊断HS的常用方法有血常规与血涂片检测、红细胞渗透脆性试验及酸化甘油溶解试验，但均容易漏诊无明显溶血表现的轻型HS患者[2]–[5]，同时不能区分原发和继发性HS（例如自身免疫性溶血性贫血伴有球形红细胞增多）[6]–[8]。近年来利用流式细胞术检测伊红-5′-马来酰亚胺（EMA）标记红细胞成为诊断HS的新手段[9]。EMA荧光探针与带3蛋白复合物相互作用，可直接靶向HS的结构缺陷[10]，具有较高的灵敏性和特异性[11]–[19]。本研究中我们收集我院确诊HS及非HS的血液病患者外周血标本，采用EMA标记流式细胞术检测、酸化甘油溶解试验及红细胞渗透脆性试验进行再诊断，比较各试验的灵敏性及特异性，验证流式细胞术检测EMA标记红细胞在HS中的诊断价值；并通过观察不同条件下试剂及样本的稳定性，探讨试验的适宜条件。

对象和方法

一、研究对象

以2014年2月至10月我院确诊的HS及非HS患者外周血标本为研究对象，其中HS患者80例，男女比为1∶1.11，中位年龄15(1~65)岁。非HS患者44例，男女比为1∶1.44，中位年龄35(29~72)岁。

二、方法

1．EMA标记的流式细胞术：取HS及非HS患者外周血2 µl, PBS洗涤1次，270×g离心5 min，加入0.5 mg/ml EMA流式荧光探针（美国life technologies公司产品）20 µl，室温避光孵育1 h，用含0.5％牛血清白蛋白的PBS液洗涤沉淀3次，270×g离心5 min，弃上清，用500 µl PBS重悬细胞，上流式细胞仪（美国Beckman Coulter公司产品）进行检测。FITC通道获取50 000个细胞，应用Navios软件进行数据分析。以检测当日6份非贫血患者外周血样本[平均荧光强度（MCF）变异系数<6%]为阴性对照，并设空白对照。每组设2个复管。

$$\text{MCF}降低的百分比（\%）=\frac{\text{MCF}对照组-\text{MCF}实验组}{\text{MCF}对照组}\times \text{1}00\%$$

参照文献[14]标准并结合工作实际，我们定义：MCF降低的百分比>16％为HS，<16％为非HS。

2．酸化甘油溶解试验：取室温平衡的0.1 mol/L磷酸盐缓冲液5 ml，加入12 µl红细胞制成红细胞悬液；取0.1 mol/L磷酸盐缓冲液3 ml于比色杯中调零；取0.3 mol/L甘油缓冲液2 ml放入另一比色杯中，加入红细胞悬液1 ml，快速混匀，用625 nm波长连续测定吸光度（A）值，10 s后开始读数，每10 s读数1次至290 s，记录A值下降至50％初始值所用时间。生物参考区间：>290 s。

3．红细胞渗透脆性试验：取11支小试管，分别加入0.24%、0.28%、0.32%、0.36%、0.40%、0.44%、0.48%、0.52%、0.56%、0.60%、0.90％的氯化钠溶液1 ml；各管再加入全血20 µl；混匀后置冰箱中24 h观察结果。结果判读：①不溶血：上清液无红色；②开始溶血：上清液开始呈透明红色且管底有红细胞；③完全溶血：溶液为透明红色且管底无红细胞或仅有少量红细胞残骸。生物参考区间（氯化钠溶液浓度）：开始溶血：0.44%~0.48%；完全溶血：0.28%~0.36%。

三、分组试验

为了验证不同条件下试剂和样本的稳定性，我们分组如下进行试验：①以−80 °C储存180 d和4 °C储存1 d的EMA分别标记同一样本，共检测12份（包括3份HS），观察不同温度EMA的稳定性；②以4 °C储存1 d和4 °C储存2 d的EMA分别标记同一样本，共检测12份（包括3份HS），观察同一温度放置不同时间EMA的稳定性；③EMA标记样本后当天（0 d）及4 °C条件下放置1~5 d进行检测，共检测7份样本，包括3份HS和4份非HS，观察EMA标记样本后不同时间的稳定性；④样本采集当天（0 d）及4 °C条件下放置1~6 d后予EMA标记并检测，共检测10份样本，包括4份HS和6份非HS，观察样本于4 °C条件下放置不同时间的稳定性；⑤样本采集当天（0 d）及室温条件下放置1~6 d后予EMA标记并检测，共检测9份标本，包括3份HS和6份非HS，观察样本于室温条件下放置不同时间的稳定性。

四、统计学处理

应用SPSS 13.0软件进行统计学分析。灵敏性和特异性采用四格表法计算，采用ROC曲线法确定cut-off值。

结果

一、诊断试验结果

三种试验分别检测已确诊的80例HS及44例非HS患者，EMA流式细胞术检测假阴性率为7.5%（80例中6例），假阳性率为4.5%（44例中2例），灵敏性为0.925，特异性为0.954，约登指数为0.879，ROC曲线下面积及cut-off值分别为0.972与14.675%；红细胞渗透脆性试验的假阴性率为5.0%（80例中4例），假阳性率为54.5%（44例中24例），灵敏性为0.950，特异性为0.455，约登指数为0.404，ROC曲线下面积为0.849（开始溶血）、0.696（完全溶血），cut-off值为0.540（开始溶血）、0.340（完全溶血）（均为氯化钠溶液浓度）；酸化甘油溶解试验中假阴性率为0，但假阳性率为68.2%（44例中30例），灵敏性为1.000，特异性为0.318，约登指数为0.318，ROC曲线下面积及cut-off值分别为0.276与291 s。

二、稳定性验证

1．试剂的稳定性：−80 °C储存180 d、4 °C储存1 d及4 °C储存2 d的EMA分别标记样本红细胞并上机检测，3组红细胞膜上MCF分别为46.99±7.67、29.20±6.90及20.22±6.71，随着储存温度的升高及存放时间的延长降低。将EMA标记样本红细胞后当天（0 d）及4 °C条件下放置1~5 d分别上流式细胞仪进行检测，结果显示EMA标记3份HS标本及4份非HS标本第0~5天红细胞膜上MCF无明显变化（图1），提示EMA与细胞结合后较为稳定。

图1. 流式细胞术检测伊红-5′-马来酰亚胺标记遗传性球形红细胞增多症（HS）及非HS样本后于4 °C条件下放置不同时间红细胞膜平均荧光强度变化.

2．样本的稳定性：为观察待测样本的稳定性，我们将待测样本分别置于4 °C及室温条件下，取当天（0 d）及放置1~6 d的样本与EMA结合并上机检测，观察MCF的变化。结果见图2、3，样本在4 °C条件下放置0~6 d检测的结果仍然很稳定，并不会影响结果的判断。非HS患者室温条件下放置0~6 d红细胞膜表面的MCF变化不大，但HS患者的红细胞膜表面的MCF在室温放置的第4天时开始显著下降。

图2. 流式细胞术检测遗传性球形红细胞增多症（HS）及非HS样本于4 °C条件下放置不同时间后予伊红-5′-马来酰亚胺标记红细胞膜平均荧光强度变化.

图3. 流式细胞术检测遗传性球形红细胞增多症（HS）及非HS样本于室温下放置不同时间后予伊红-5′-马来酰亚胺标记红细胞膜平均荧光强度变化.

讨论

HS中红细胞异常是由于血影蛋白、带3蛋白、锚蛋白和蛋白4.2中的一种或几种蛋白联合缺陷导致细胞膜骨架蛋白异常，从而使红细胞变形能力降低。EMA中马来酰亚胺的一部分与带3蛋白胞外第一个环上的Lys-430共价结合，伊红所带的发光团与带3蛋白跨膜核心相连，带3蛋白N-端的胞质区与锚蛋白和蛋白4.2相互作用，所以EMA在与带3蛋白结合的同时，也探测到了锚蛋白和蛋白4.2，从而提高了此方法检测HS的灵敏性和特异性[11]。

酸化甘油溶解试验和红细胞渗透脆性试验检测HS的原理是利用患者中红细胞的表面积与体积比降低，测定一定时间内红细胞裂解的比例或程度；这类方法易受到其他不相关红细胞骨架缺陷的影响，不能检测出轻微或不典型的HS。红细胞渗透脆性试验虽然灵敏性稍高于EMA流式细胞术检测，但其特异性太低，阳性结果可由免疫异常或其他疾病引起。综合以上试验结果，可以看出EMA作为特异性荧光探针检测遗传性球形红细胞，具有很好的灵敏性和特异性，在HS的临床诊断辅助检查方面具有明显的优越性。

同时，酸化甘油溶解试验受温度影响较大，最佳温度25 °C。红细胞渗透脆性试验耗时长，需要24 h。且以上两种方法操作相对繁琐，所需样本量较EMA流式细胞术多。EMA流式细胞术检测所需样本量少（仅4 µl）且可储存；检测速度快，2 h内即可出结果；标本在4 °C放置1周时间不会影响结果的判定；实验流程简单。有文献报道通过运输过程的样本，检测结果不受影响[20]。

但是，EMA本身对温度敏感，需要−80 °C冰箱储存不超过180 d，所以根据日检测标本数量对试剂进行小剂量分装十分必要。试剂的保存是影响实验结果的重要因素，应予以重视。同时我们对样本的稳定性做了多方面验证，结果显示EMA在−80 °C条件下能很好地保持其稳定性，并且与样本结合后在4 °C条件下放置2~3 d仍然稳定。如果不能立即处理采集好的样品，室温放置须不超过4 d或4 °C冰箱存储不超过6 d。各实验室可以根据样本数量合理安排试验进度。