Abstract
目的
探究选择性JAK1抑制剂SHR0302和芦可替尼对骨髓增殖性肿瘤（MPN）细胞株SET2细胞和MPN患者原代细胞的影响以及分子作用机制。
方法
CCK8法检测不同浓度SHR0302和芦可替尼对SET2细胞增殖能力的影响；集落形成实验检测SHR0302和芦可替尼对MPN患者原代细胞红系爆式集落形成单位（BFU-E）的作用；多因子检测试剂盒MSD检测SHR0302和芦可替尼对SET2细胞IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-8、IL-12p70蛋白表达水平的影响；以Western blot法检测SHR0302和芦可替尼对SET2细胞JAK-STAT信号通路分子磷酸化水平的影响。
结果
0.1、1.0、2.5、5.0 µmol/L SHR0302作用SET2细胞24、48、72 h，细胞增殖抑制率随药物浓度的增大而增高（P< 0.001）；0.01、0.05、0.10 µmol/L芦可替尼作用SET2细胞48、72 h，细胞增殖抑制率亦随药物浓度的增大而增高（P<0.001），且均在72 h抑制作用最显著。2.5 µmol/L SHR0302、0.1 µmol/L芦可替尼作用SET2细胞72 h，细胞增殖抑制率分别为（59.94±0.60）％、（64.00±0.66）％，提示SHR0302的增殖抑制作用弱于芦可替尼。与对照组比较，0.1、1.0、5.0 µmol/L SHR0302和0.1、0.2、0.4 µmol/L芦可替尼均浓度依赖性地抑制MPN患者BFU-E形成，1.0 µmol/L SHR0302对MPN患者BFU-E集落形成抑制程度与0.2 µmol/L芦可替尼相当。除IL-12外，1.6 µmol/L SHR0302作用SET2细胞24 h可明显抑制炎性介质蛋白IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-8表达（P<0.01），与1.0 µmol/L芦可替尼对炎性介质抑制作用相当。不同浓度SHR0302作用SET2细胞3 h后JAK-STAT信号通路显著抑制，在1.0 µmol/L时可显著抑制p-STAT1（Tyr701）、p-STAT3（Tyr705）蛋白磷酸化，在5.0 µmol/L时可使p-JAK1（Tyr1022/1023）、p-STAT5（Tyr694）蛋白磷酸化水平明显下调（P<0.05），而芦可替尼在0.1 µmol/L即可明显抑制下游STAT蛋白磷酸化水平。
结论
SHR0302能有效抑制MPN细胞株和患者原代细胞的增殖以及炎性因子表达，其机制可能与下调p-JAK1及其下游p-STAT1、p-STAT3、p-STAT5蛋白磷酸化水平相关，但其抗增殖、抗炎作用弱于芦可替尼。
Keywords: 选择性JAK1抑制剂SHR0302, 芦可替尼, 细胞增殖, 炎性细胞因子, JAK-STAT信号通路
Abstract
Objective
To explore the effects and molecular mechanism of the selective JAK1inhibitor SHR0302 and Ruxolitinib on myeloproliterative neoplasms（MPN）cell line SET2 and primary cells in vitro.
Methods
Cell proliferation was detected by CCK8 kit. Colony forming experiment was conducted to evaluate erythroid burst colony formation unit（BFU-E）of primary cells from MPN patients. Multi-factor kits were used to detect six inflammatory cytokines. Phosphorylated proteins of Jak-Stat signaling pathway were tested by Western blot.
Results
At different time points after treated with SHR0302 and Ruxolitinib, the inhibition of cell proliferation was dose dependent by both drugs（P<0.01）. The inhibitory rates of 2.5 µmol/L SHR0302 and 0.1 µmol/L Ruxolitinib on SET2 cells for 72 h were comparable, i.e.（59.94±0.60）％ and（64.00±0.66）％, respectively, suggesting that the inhibitory effect of SHR0302 was weaker than that of Ruxolitinib. Similarly, both SHR0302 and Ruxolitinib inhibited BFU-E in primary marrow cells from MPN patients in a dose-dependent manner. SHR0302 1.0 µmol/L produced similar degree of inhibition compared to Ruxolitinib 0.2 µmol/L. Except IL-12, the expression of other 5 cytokines（IL-6, TNF-α, IL-1β, IL-2, IL-8）was significantly inhibited by 1.6 µmol/L SHR0302 in SET2 cells at 24 h（P<0.01）, while Ruxolitinib 1.0 µmol/L had the same effect. Several phosphorylated molecules of Jak-Stat signaling pathway were significantly inhibited by SHR0302 in SET2 cells only for 3 h. P-stat1（Tyr701）, p-stat3（Tyr705）were down-regulated when treated with SHR0302 1.0 µmol/L（P< 0.05）, p-jak1（tyr1022/1023）and p-stat5（Tyr694）were inhibited at 5.0 µmol/L（P<0.05）. Ruxolitinib significantly inhibited the downstream STAT protein at 0.1 µmol/L. Again, the inhibitory effect of SHR0302 on protein expression was weaker than that of Ruxolitinib.
Conclusion
SHR0302 can effectively inhibit the proliferation of MPN cell line and patients' primary cells, as well as the expression of inflammatory factors. The molecular mechanism is possibly related to the down-regulation of phosphorylated proteins of Jak-Stat signaling pathway. Overall, the anti-proliferative and anti-inflammatory effects of SHR0302 are weaker than those of Ruxolitinib.
Keywords: Selective JAK1 inhibitor SHR0302, Ruxolitinib, Cell proliferation, Inflammatory cytokine, JAK-STAT signaling pathway
JAK2V617F基因突变异常活化JAK-STAT信号通路，促使骨髓增殖性肿瘤（MPN）患者骨髓细胞过度增殖，释放大量炎性细胞因子并发生相应的体质性症状，从而生活质量下降，预期寿命缩短[1]。JAK1/2激酶抑制剂芦可替尼治疗骨髓纤维化，可显著减轻患者的体质症状，但贫血和血小板减少等药物不良反应是早期治疗失败的主要原因[2]–[3]，近期报道的几个JAK2激酶抑制剂Ⅲ期临床试验结果也并不理想[4]。SHR0302是一种新的JAK小分子抑制剂，主要作用于JAK1激酶[5]。新近报道的JAK1选择性抑制剂INCB039110治疗骨髓纤维化的Ⅱ期临床试验结果表明该药可有效降低患者症状负荷，且有一定的缩脾效果，而且骨髓抑制相对较轻[6]。为了探讨SHR0302在MPN的潜在临床应用价值，我们对SHR0302在MPN细胞系SET2和患者原代细胞的增殖和炎性细胞因子表达水平抑制作用进行了初步研究。
材料与方法
1. 主要试剂：SHR0302（江苏豪森药业股份有限公司药物研究院惠赠）和芦可替尼（购于德国Selleck公司）溶于DMSO，−80°C保存。RPMI1640培养基和胎牛血清购于美国Gibco公司，Cell Counting Kit8（CCK8）试剂购于日本同仁化学研究所，甲基纤维素培养基（Metho Cult H4435）购于加拿大Stem Cell公司，GAPDH多克隆抗体购于美国Bioworld Technology公司，p-JAK1（Tyr1022/1023）、JAK1、p-STAT1（Tyr701）、STAT1、p-STAT3（Tyr705）、STAT3、p-STAT5（Tyr694）和STAT5单克隆抗体均购于美国CST公司，羊抗兔HRP二抗购于美国Cell Signaling公司。多因子检测试剂盒（MSD）购于上海优宁维生物有限公司。
2. 细胞来源和细胞培养：SET2细胞系（JAK2V617F杂合突变）由美国辛辛那提儿童医院黄刚教授赠予。MPN患者原代细胞取自我院MDS诊疗中心住院患者（患者签署知情同意书）。SET2细胞和MPN患者原代骨髓单个核细胞（BM-MNC）用含有20％胎牛血清的RPMI1640培养基培养。细胞均置于37°C、5％CO2培养箱中培养。实验所用细胞均处于对数生长期。
3. CCK8法检测药物对细胞增殖的影响：取对数生长期的SET2细胞接种于96孔板，加入SHR0302，使其终浓度为0、0.1、1.0、2.5、5.0 µmol/L，芦可替尼终浓度为0、0.01、0.05、0.1 µmol/L，每组设5个平行复孔，在培养箱中培养24、48、72 h后，加入10 µl CCK-8溶液并继续孵育3 h，用酶标仪检测450 nm处各孔的吸光度（A）值，计算细胞增殖抑制率。
4. 甲基纤维素细胞集落形成实验：甲基纤维素H4435提前分装至无菌西林瓶中，收集药物处理24 h后MPN患者原代细胞加入至无菌西林瓶中。SHR0302浓度为0、0.1、1.0、5.0 µmol/L，芦可替尼浓度为0、0.1、0.2、0.4 µmol/L，每组设3个平行复孔，每瓶加入两倍的双抗，振荡器充分振荡混匀，吸取混有细胞的半固体培养基接种于24孔板，MPN患者原代细胞每孔接种1×105个，7～14 d后观察红系爆式集落形成单位（BFU-E）形成能力并用倒置显微镜拍照。
5. 炎性细胞因子水平测定：6孔板接种细胞密度为1.5×106/ml，根据CCK8推算SHR0302对SET2细胞株的IC50值，以此确定SHR0302对SET2细胞株的适宜作用浓度为1.611 µmol/L。分别为0、1.6 µmol/L SHR0302作用于SET2细胞，选定的芦可替尼作用浓度分别为0、0.2、0.4、0.8、1.0 µmol/L。培养24 h后吸取细胞上清至0.5 ml EP管，每种浓度分装2管（每管300 µl）送至上海优宁维公司进行检测。
6. Western blot法测定JAK-STAT信号通路相关蛋白表达：分别收集药物处理组及未处理组细胞，用含有蛋白酶及磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液裂解细胞，提取细胞总蛋白，测定蛋白浓度，每孔蛋白上样量为30 µg，于8％ SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳2 h，湿转印至膜，50 g/L的脱脂奶粉室温封闭1 h后，加入相应的一抗孵育，4°C过夜。PBST洗膜3次（每次10 min），用HRP标记的二抗室温孵育1 h，ECL发光液显色并进行图像采集，采用Image J分析软件进行灰度扫描。
7. 统计学处理：采用SPSS 23.0及Graphpad Prism 6.0软件进行数据分析，组间均数的比较用one-way ANOVA进行检验，多种因素组间的比较采用two-way ANOVA进行检验，P<0.05为差异有统计学意义。
结果
1. SHR0302和芦可替尼对SET2细胞增殖的影响：药物对细胞的增殖抑制呈时间和剂量依赖性（表1、表2），以72 h抑制作用最显著，SHR0302、芦可替尼对SET2细胞的IC50值分别为1.611 µmol/L、0.103 µmol/L。作用72 h后，2.5 µmol/L SHR0302、0.1 µmol/L芦可替尼的增殖抑制率分别为（59.94± 0.60）％、（64.00±0.66）％。
表1. 不同浓度SHR0302作用SET2细胞不同时间的细胞增殖抑制率（％，x±s，实验重复3次）.
| 组别 | 24 h | 48 h | 72 h |
| 0 µmol/L处理组 | 0.00±0.01 | 0.00±0.18 | 0.00±0.33 |
| 0.1 µmol/L处理组 | 1.25±0.03 | 9.86±0.03 | 7.83±1.27 |
| 1.0 µmol/L处理组 | 4.80±0.05 | 10.22±0.12 | 29.02±0.13 |
| 2.5 µmol/L处理组 | 4.98±0.01 | 22.22±0.14 | 59.94±0.60 |
| 5 µmol/L处理组 | 9.57±0.01 | 29.02±0.18 | 75.31±0.32 |
| P值 | <0.05 | <0.05 | <0.001 |
表2. 不同浓度芦可替尼作用SET2细胞48、72 h的细胞增殖抑制率（％，x±s，实验重复3次）.
| 组别 | 48 h | 72 h |
| 0 µmol/L处理组 | 0.00±0.01 | 0.00±1.32 |
| 0.01 µmol/L处理组 | 13.58±0.02 | 11.91±2.67 |
| 0.05 µmol/L处理组 | 23.53±0.18 | 31.35±1.14 |
| 0.1 µmol/L处理组 | 27.06±0.13 | 64.00±0.66 |
| P值 | <0.001 | <0.001 |
2. SHR0302和芦可替尼对MPM患者原代细胞BFU-E集落形成能力的影响：不同浓度SHR0302（0、0.1、1.0、5.0 µmol/L）和芦可替尼（0、0.1、0.2、0.4 µmol/L）处理真性红细胞增多症（PV，2例）和原发性血小板增多症（ET，2例）原代细胞24 h后，患者BFU-U集落数随药物浓度增加而递减（图1）。SHR0302和芦可替尼在0.1 µmol/L浓度下均能抑制PV、ET患者BFU-E集落形成，1.0 µmol/L SHR0302对PV和ET患者BFU-E集落形成抑制程度与0.2 µmol/L芦可替尼相当。
图1. 不同浓度的SHR0302（A）和芦可替尼（B）与MPN患者原代细胞作用24 h后BFU-E集落形成数目（实验重复3次）.
MPN：骨髓增殖性肿瘤；BFU-E：红系爆式集落形成单位。PV1、PV2分别为第1、2例真性红细胞增多症患者，ET1、ET2分别为第1、2例原发性血小板增多症患者。与对照组（0 µmol/L）相比，aP<0.05，bP<0.01
3. SHR0302和芦可替尼对SET2细胞炎性细胞因子分泌水平的影响：1.6 µmol/L SHR0302作用SET2细胞24 h后，促炎因子IL-6、TNF-α、IL-1β表达水平较对照组均下降约50％（P<0.001），而参比药物芦克替尼对促炎因子具有选择性抑制作用，1.0 µmol/L芦可替尼处理组对IL-6的抑制作用强于1.6 µmol/L SHR0302，对TNF-α、IL-1β的抑制作用稍弱于SHR0302（表3、4）。1.6 µmol/L SHR0302对影响MPN患者生存和白血病转化的独立危险因素炎性因子IL-2、IL-8、IL-12p70的抑制作用与1.0 µmol/L芦可替尼相当，除IL-12p70以外，与对照组（0 µmol/L）相比均具有统计学意义（P<0.01）（表5、6）。
表3. 不同浓度SHR0302作用SET2细胞24 h后IL-6、TNF-α、IL-1β的表达（pg/ml，x±s，实验重复3次）.
| 组别 | IL-6 | TNF-α | IL-1β |
| 0 µmol/L处理组 | 1.32±0.01 | 9.16±0.25 | 2.19±0.01 |
| 1.6 µmol/L处理组 | 0.60±0.03 | 4.04±0.31 | 1.17±0.04 |
| P值 | <0.001 | <0.001 | <0.001 |
表4. 不同浓度芦可替尼作用SET2细胞24 h后IL-6、TNF-α、IL-1β的表达（pg/ml，x±s，实验重复3次）.
| 组别 | IL-6 | TNF-α | IL-1β |
| 0 µmol/L处理组 | 18.83±0.08 | 27.53±0.70 | 13.75±1.00 |
| 0.2 µmol/L处理组 | 10.85±0.13 | 20.98±4.44 | 10.68±0.62 |
| 0.4 µmol/L处理组 | 9.30±0.47 | 17.69±3.05 | 9.93±0.38 |
| 0.8 µmol/L处理组 | 7.90±0.13 | 13.24±0.22 | 8.58±0.17 |
| 1.0 µmol/L处理组 | 7.24±0.40 | 7.97±0.45 | 12.65±0.37 |
| P值 | <0.001 | 0.008 | 0.001 |
表5. 不同浓度SHR0302作用SET2细胞24 h后IL-2、IL-8、IL-12p70表达水平（pg/ml，x±s，实验重复3次）.
| 组别 | IL-2 | IL-8 | IL-12p70 |
| 0 µmol/L处理组 | 1.04±0.03 | 332.92±6.40 | 0.34±0.04 |
| 1.6 µmol/L处理组 | 0.71±0.01 | 161.98±6.17 | 0.22±0.02 |
| P值 | 0.004 | 0.001 | 0.069 |
表6. 不同浓度芦可替尼作用SET2细胞24 h后IL-2、IL-8、IL-12p70表达水平（pg/ml，x±s，实验重复3次）.
| 组别 | IL-6 | TNF-α | IL-1β |
| 0 µmol/L处理组 | 18.83±0.08 | 27.53±0.70 | 13.75±1.00 |
| 0.2 µmol/L处理组 | 10.85±0.13 | 20.98±4.44 | 10.68±0.62 |
| 0.4 µmol/L处理组 | 9.30±0.47 | 17.69±3.05 | 9.93±0.38 |
| 0.8 µmol/L处理组 | 7.90±0.13 | 13.24±0.22 | 8.58±0.17 |
| 1.0 µmol/L处理组 | 7.24±0.40 | 7.97±0.45 | 12.65±0.37 |
| P值 | <0.001 | 0.008 | 0.001 |
4. SHR0302和芦可替尼对SET2细胞JAK-STAT信号通路及相应蛋白的影响：以不同浓度（0、0.1、1.0、5 µmol/L）SHR0302和芦可替尼处理SET2细胞3 h后，p-JAK1（Tyr1022/1023）、p-STAT1（Tyr701）、p-STAT3（Tyr705）、p-STAT5（Tyr694）蛋白磷酸化水平随药物浓度增加而下调（P<0.05）（图2），SHR0302抑制JAK-STAT通路的起效浓度为1.0 µmol/L，芦可替尼起效浓度为0.1 µmol/L。
图2. Western blot法检测不同浓度SHR0302（A）和芦可替尼（B）对SET2细胞JAK-STAT信号通路蛋白表达的影响.
1、2、3、4分别为0、0.1、1.0、5.0 µmol/L处理组
讨论
JAK2V617F基因突变使JAK-STAT信号通路异常激活，不仅导致恶性克隆扩增，还可促进炎性细胞因子释放[7]–[8]。Tefferi等[9]的研究表明MPN患者血清中高水平的炎症细胞因子与患者症状负荷相关，可影响患者的临床病程和生存预后。其他研究亦证实IL-8、IL-2受体、IL-12和IL-15水平是影响MPN患者生存和白血病转化的独立危险因素[1],[10]。因此，抑制异常活化的炎性反应也是MPN的治疗策略之一。
选择性JAK1抑制剂SHR0302是一种酪氨酸激酶小分子抑制剂，体外实验证实SHR0302对JAK1激酶的选择性明显优于JAK2、JAK3和Tyk2[5]。在佐剂诱导的小鼠胶原性关节炎（adjuvant-induced arthritis, AA）模型中，SHR0302可通过抑制JAK1-STAT3通路抑制Th17和B淋巴细胞的增殖，下调炎性细胞因子TNF-α、IL-1和IL-17，AA小鼠服用SHR0302药物后关节及鼠爪肿胀程度减轻，脾脏及关节的组织病理学改变有所缓解[10]。在肝纤维化体外实验中，Wu等[5]证实SHR0302可通过抑制JAK1-STAT3及AKT信号通路而诱导肝星状细胞的凋亡，进而抑制肝星状细胞增殖和胶原纤维的产生。本研究我们发现SHR0302作用于SET2细胞可显著抑制细胞增殖且呈明显的时间和剂量依赖性，并且SHR0302作用24 h即可明显抑制MPN患者BFU-E集落形成，但其抑制细胞增殖的作用浓度显著高于芦可替尼。此外，对炎性细胞因子表达水平抑制达50％的SHR0302作用浓度亦高于芦可替尼。
MPN中STAT1和STAT3的激活可促进炎性细胞因子分泌，活化的STAT5激活则主要调控与细胞增殖、生存和凋亡相关基因的表达[1]。本研究发现芦可替尼可同时抑制磷酸化STAT1、STAT3和STAT5，而SHR0302对磷酸化STAT5的抑制作用弱于磷酸化STAT1和STAT3，提示该药主要发挥抗炎作用。
本研究结果显示，SHR0302可能通过抑制MPN肿瘤细胞磷酸化STAT5发挥抗增殖作用，其抗炎作用可能与抑制JAK1-STAT1/3信号通路有关。虽然SHR0302的抗增殖和抗炎作用弱于芦可替尼，但芦可替尼主要通过抑制磷酸化STAT5发挥抗增殖作用，SHR0302则以JAK1-STAT1/3为主要作用靶点，二者作用靶点的区别提示临床联合用药的可能性值得进一步研究。
Funding Statement
基金项目：国家自然科学基金（81530008、81770129）；中国医学科学院医学与健康科技创新工程项目（2016-I2M-1-001）；实验血液学国家重点实验室自主课题（Z17-03）；天津市科技计划（15ZXLCSY00010）
Fund program: National Natural Science Funds（81530008, 81770129）; CAMS Initiative Fund for Medical Sciences（2016-I2M-1-001）; SKLEH-Pilot Research Grant（Z17-03）; Science and technology project of Tianjin（15ZXLCSY00010）
References
- 1.Mendez Luque LF, Blackmon AL, Ramanathan G, et al. Key role of inflammation in myeloproliferative neoplasms: instigator of disease initiation, progression. and symptoms[J] Curr Hematol Malig Rep. 2019;14(3):145–153. doi: 10.1007/s11899-019-00508-w. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 2.肖 志坚. 我如何治疗原发性骨髓纤维化[J] 中华血液学杂志. 2019;40(3):179–181. doi: 10.3760/cma.j.issn.0253-2727.2019.03.002. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 3.金 洁, 杜 欣, 周 道斌, et al. JAK抑制剂芦可替尼治疗中国骨髓纤维化患者的疗效和安全性: A2202随访一年结果[J] 中华血液学杂志. 2016;37(10):858–863. doi: 10.3760/cma.j.issn.0253-2727.2016.10.007. [DOI] [Google Scholar]
- 4.Pardanani A, Tefferi A. How I treat myelofibrosis after failure of JAK inhibitors[J] Blood. 2018;132(5):492–500. doi: 10.1182/blood-2018-02-785923. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 5.Wu H, Yan S, Chen J, et al. JAK1-STAT3 blockade by JAK inhibitor SHR0302 attenuates inflammatory responses of adjuvant-induced arthritis rats and decreases Th17 and total B cells[J] J Joint Bone Spine. 2016;83(5):525–532. doi: 10.1016/j.jbspin.2015.09.002. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 6.Mascarenhas JO, Talpaz M, Gupta V, et al. Primary analysis of a phase II open-label trial of INCB039110, a selective JAK1 inhibitor, in patients with myelofibrosis[J] Haematologica. 2017;102(2):327–335. doi: 10.3324/haematol.2016.151126. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 7.Lussana F, Rambaldi A. Inflammation and myeloproliferative neoplasms[J] J Autoimmun. 2017;85:58–63. doi: 10.1016/j.jaut.2017.06.010. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 8.Kleppe M, Kwak M, Koppikar P, et al. JAK-STAT pathway activation in malignant and nonmalignant cells contributes to MPN pathogenesis and therapeutic response[J] Cancer Discov. 2015;5(3):316–331. doi: 10.1158/2159-8290.CD-14-0736. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 9.Tefferi A, Vaidya R, Caramazza D, et al. Circulating interleukin (IL)-8, IL-2R, IL-12, and IL-15 levels are independently prognostic in primary myelofibrosis: a comprehensive cytokine profiling study[J] J Clin Oncol. 2011;29(10):1356–1363. doi: 10.1200/JCO.2010.32.9490. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 10.Gu YJ, Sun WY, Zhang S, et al. Targeted blockade of JAK/STAT3 signaling inhibits proliferation, migration and collagen production as well as inducing the apoptosis of hepatic stellate cells[J] Int J Mol Med. 2016;38(3):903–911. doi: 10.3892/ijmm.2016.2692. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]