NPM1基因表达对急性髓系白血病细胞系的影响及其机制探讨

Abstract

目的

探讨NPM1基因表达对急性髓系白血病（AML）细胞系的影响及其机制。

方法

选取AML细胞系U937和HL-60细胞，转染NPM1质粒至细胞系构建稳定克隆，采用Western blot法鉴定高表达NPM1蛋白的单克隆细胞。MTT法检测细胞增殖活性，流式细胞术检测细胞周期分布和细胞凋亡率，显微镜下计数检测集落形成能力，Western blot法检测细胞周期相关信号通路蛋白表达，实时荧光定量PCR（RQ-PCR）法检测初诊AML患者骨髓单个核细胞NPM1基因表达水平。

结果

①U937和HL-60细胞中NPM1高表达组相对细胞增殖率与对照组相比，差异无统计学意义（4.68±1.28对3.89±0.81，3.34±0.37对2.68±0.29，P值均>0.05）。②U937和HL-60细胞中NPM1高表达组S期细胞比例均明显高于对照组[（50.22±3.42）%对（39.78±3.80）%，（59.01±3.27）%对（43.94±2.08）%，P值均<0.05]。③U937细胞NPM1高表达组和对照组相比具有更强的抗凋亡能力[（48.67±3.22）%和（68.77±10.21）%，P<0.05]和集落形成能力（772.7±24.0和652.3±16.5，P<0.05），而HL-60细胞相应的两组细胞上述能力均相似。④NPM1高表达组细胞中CDK4、Cyclin D1、Cyclin D2及Cyclin E表达明显高于对照组，而Cyclin D3表达明显低于对照组。⑤细胞遗传学预后良好组AML患者NPM1定量水平低于预后中等组。

结论

NPM1蛋白能够促进更多的细胞进入S期，增强抗凋亡和细胞集落形成能力。NPM1定量水平可能预示细胞遗传学的危险度。

核仁磷酸蛋白（NPM1），又称为B23，主要定位于细胞核仁中，在胞质和胞核中穿梭，主要参与细胞核糖体合成、中心体复制、DNA修复等过程，另外还与P53、ARF等蛋白共同调控细胞凋亡[1]–[5]。目前发现NPM1蛋白在多种恶性肿瘤细胞中高表达，如胃癌、结肠癌、前列腺癌、膀胱癌[6]–[10]。

NPM1基因与急性白血病关系的研究主要集中于携带NPM1突变的急性髓系白血病（AML），该类型白血病预后良好，对化疗敏感，其中NPM1突变水平可作为微小残留病（MRD）监测的重要指标[11]–[12]。此外，NPM1可与其他基因形成融合蛋白，如NPM-RARα、NPM-MLF1[13]–[14]。但是野生型NPM1基因的异常表达在急性白血病中的作用尚未得到充分关注，因此本研究通过构建野生型NPM1载体，转染常见人类白血病细胞系U937和HL-60细胞，探讨NPM1基因高表达对白血病细胞的影响。同时定量检测不同类型初诊急性白血病患者的NPM1 mRNA定量负荷，评价NPM1表达水平对危险度的影响。

材料与方法

1．细胞培养：人类白血病细胞系U937和HL-60细胞由本实验室保存，于含10%灭活胎牛血清（FBS）的RPMI 1640培养基，置于37 °C、5%CO₂的培养箱中培养，取对数生长期的细胞用于实验。

2．质粒构建、转染及单克隆细胞系建立：NPM1质粒由原代患者骨髓细胞中通过PCR扩增得来，通过酶切位点克隆进入pcDNA3.1-myc质粒中。将pcDNA3.1空载体、NPM1质粒通过lipofectamine2000转染至U937和HL-60细胞，通过极限稀释法、Western blot鉴定，挑选高表达NPM1蛋白的细胞系作为实验组，而转染空载体的细胞系作为对照组。

3．细胞周期测定：将细胞离心后用PBS洗涤，以75%乙醇固定至少24 h，3 ml RNA酶和150 ml碘化丙锭（PI）室温孵育10~15 min，通过FACS LSRⅡ流式细胞仪（美国BD Bioscience公司产品）测定细胞周期。

4．细胞增殖活性测定：将对数生长期细胞以1×10⁴/孔接种于96孔板，检测时间点加入10 ml MTT，4 h后加入10% SDS 100 ml孵育12~16 h，通过酶标仪（美国BioTekInstruments公司产品）检测546 nm波长处吸光度（A）值，计算细胞增殖活性。

5．细胞凋亡测定：将对数生长期细胞与化疗药物孵育48 h后，收集细胞离心，PBS洗涤后重悬于50 ml结合缓冲液中，分别加入2 ml Annexin-Ⅴ和3.5 ml PI，混匀后避光孵育15 min，最后加入100~150 ml结合缓冲液，通过FACS LSRⅡ流式细胞仪检测细胞凋亡比例。

6．细胞集落形成检测：收集对数生长期细胞，将细胞吹散成单个细胞悬于含有2% FBS的IMDM培养液中，制成1×10⁵/ml的细胞悬液，将细胞悬液与甲基纤维素培养基按1∶10比例吹打混合均匀，将混合体系转移接种于96孔板中，每孔100 ml，每组设3个平行孔；置于37 °C、5% CO₂、湿度≥95%孵箱培养7 d，计数集落，Nikon Eclipse TS100显微镜照相（日本Niklon公司产品）。

7．实时荧光定量PCR（RQ-PCR）检测NPM1 mRNA水平：NPM1基因正向引物：5′-TGTGAACTAAAGGCCGACAA-3′，反向引物：5′-TATTT CAAAGCCCCCAAGG-3′，产物大小为234 bp，内参对照为GAPDH。反应体系（10 µl）：2×SYBR Premix Ex Taq 10 µl，Rox DyeⅡ0.4 µl，正向引物0.4 µl，反向引物0.4 µl，cDNA 2 µl，ddH₂O 6.8 µl。反应条件：95 °C预变性30 s；95 °C变性5 s，60 °C延伸34 s，重复40个周期。样本NPM1 mRNA相对表达量（RQ）用2^−ΔΔCt计算。

8．原代骨髓标本采集：收集中国医学科学院血液病医院2009年9月至2010年9月间5例原发免疫性血小板减少症（ITP）患者（对照组）和42例初诊急性白血病患者骨髓标本，其中急性B淋巴细胞白血病（B-ALL）5例，AML37例（M_2a 7例，M_2b 9例，M₃ 6例，M₄/M₅ 11例，M₆ 4例）。采用淋巴细胞分离液提取骨髓单个核细胞。

9．统计学处理：采用SPSS17.0软件进行统计学分析。两组细胞生物学实验数据比较采用独立样本t检验，多组细胞生物学实验数据比较采用方差分析，每组实验至少重复3次。各组NPM1定量水平比较采用非参数检测（两组间采用Mann-Whiteny U检验；多组间采用Kruskal-Wallis H检验）。P<0.05为差异有统计学意义。

结果

一、NPM1基因表达对白血病细胞生物学特性的影响

1．细胞增殖：U937对照组和实验组细胞培养72 h，细胞相对增殖率（与培养0 h时的比值）分别为3.89±0.81和4.68±1.28，差异无统计学意义（t=1.661, P>0.05）；HL-60细胞两组相对增殖率分别为2.68±0.29和3.34±0.37，差异亦无统计学意义（t=1.220, P>0.05）。

2．细胞周期：U937对照组和实验组细胞经48 h孵育，S期细胞比例分别为（39.78±3.80）%和（50.22±3.42）%，G₀/G₁期细胞比例分别为（50.61±4.77）%和（36.42±3.16）%。HL-60细胞两组S期细胞的比例分别为（43.94±2.08）%和（59.01±3.27）%，G₀/G₁期细胞比例分别为（39.46±0.74）%和（27.82±1.13）%。U937和HL-60细胞实验组S期比例均明显高于对照组（t=10.46，P<0.001；t=12.02，P<0.001），而G₀/G₁期比例明显低于对照组（t=7.706，P<0.001；t=15.56，P<0.001）。

3．细胞凋亡：U937对照组和实验组细胞经1 mg/ml依托泊苷处理48 h，早期凋亡细胞比例分别为（68.77±10.21）%和（48.67±3.22）%，差异有统计学意义（t=3.81, P<0.05）；HL-60对照组和实验组细胞经0.1 mg/ml依托泊苷处理48 h，早期凋亡细胞比例分别为（44.59±11.16）%和（39.37±0.75）%，差异无统计学意义（t=1.465, P>0.05）。

4．细胞集落形成能力：U937对照组和实验组细胞在半固体培养基中培养7 d，集落数分别为652.3±16.5和772.7±24.0，差异有统计学意义（t=7.864, P<0.001）；HL-60两组细胞集落数分别为186.0±19.8和239.0±4.2，差异无统计学意义（t=2.828, P>0.05）。

二、NPM1基因表达对细胞周期相关信号通路蛋白表达的影响

如图1所示，实验组U937细胞中CDK4、Cyclin D1、Cyclin D2和Cyclin E的表达明显强于对照组，而Cyclin D3几乎不表达，提示高表达NPM1蛋白，能够增加细胞中CDK4/Cylin D1、CDK4/Cyclin D2及CDK2/Cyclin E复合物的表达，而CDK6/Cyclin D3复合物的表达受到抑制。

图1. Western blot法检测NPM1基因表达对U937细胞的细胞周期蛋白表达的影响.

1：转染空载体组；2：转染NPM1基因组

三、初诊急性白血病患者中NPM1 mRNA定量检测

我们通过RQ-PCR方法检测初诊急性白血病患者骨髓单个核细胞NPM1 mRNA的水平，并分析NPM1表达与患者预后的关系。如表1、图2所示，NPM1定量水平与NPM1突变（P=0.794）、FLT-ITD突变（P=0.164）、诱导化疗疗效（P=0.755）、FAB分型（P=0.081）及WBC（P=0.506）分组无明显相关，但与细胞遗传学分组相关（P=0.043），其中预后良好组NPM1 mRNA表达水平明显低于预后中等组（P=0.018）。

表1. 42例初诊急性白血病患者临床特征和NPM1表达水平的关系.

临床特征	例数	中位NPM1表达水平	统计量	P值
WBC			137.5	0.506
<50×109/L	32	0.953
≥50×109/L	10	1.154
FAB分型			5.0	0.081
B-ALL	5	1.020
M2b/M3	15	0.659
M2a/M4/M5/M6	22	1.454
NPM1突变			32.0	0.794
阴性	36	1.018
阳性	2	4.817
FLT3-ITD突变			43.5	0.164
阴性	38	1.042
阳性	4	0.301
诱导化疗疗效			140.0	0.755
CR	30	1.179
NR	10	0.927
细胞遗传学分组			6.3	0.043
良好	15	0.659
中等	25	1.577	102.5	0.018a
不良	2	0.777

注：B-ALL：急性B淋巴细胞白血病；CR：完全缓解；NR：未缓解；^a与良好组比较的P值

图2. 急性白血病患者不同细胞遗传学预后组骨髓单个核细胞NPM1表达水平比较.

讨论

NPM1蛋白的表达在细胞中发挥重要作用，其在多数肿瘤细胞过表达，发挥原癌蛋白的作用，包括胃癌、结肠癌、卵巢癌和前列腺癌，但其目前在AML中的作用和意义尚不明确，更多的热点集中在NPM1突变和平衡易位。本研究通过在U937和HL-60细胞系中高表达NPM1蛋白，研究高表达的NPM1蛋白在白血病细胞中的作用。研究结果显示，NPM1蛋白未对细胞增殖产生显著的影响，但能促进更多细胞进入S期，该作用可能与促进CDK4/Cylin D1、CDK4/Cyclin D2及CDK2/Cyclin E复合物的表达，抑制CDK6/Cyclin D3复合物的表达相关。同时NPM1蛋白可增强细胞抵抗化疗药物诱导的细胞凋亡的能力，增强细胞集落形成能力。通过RQ-PCR检测急性白血病患者中NPM1的表达水平，发现细胞遗传学预后良好组NPM1表达水平低于预后中等组。

目前NPM1蛋白在恶性肿瘤中的作用机制主要通过与P53相互作用实现。有研究报道结肠癌中NPM1蛋白对细胞周期的作用可通过调控P53下游蛋白p21和Cyclin D3实现[15]。本研究结果也同样显示NPM1高表达后，Cyclin D3表达量明显降低，提示其在AML中同样发挥作用。目前NPM1与Cyclin/CDK间相互作用研究较少，仍需要进一步研究。近年来，有研究在细胞系或小鼠中敲除NPM1基因，但结果显示敲除后会通过ARF途径导致细胞增殖受到抑制，NPM1表达的缺失也能导致肿瘤的发生，被认为可能是抑癌基因[16]–[17]。因此，NPM1基因的表达在肿瘤细胞尤其是急性白血病细胞的作用仍需要更多的研究予以探索和确认。

本研究中高表达NPM1的HL-60细胞与对照组细胞在细胞增殖能力、抗凋亡能力方面差异无统计学意义。可能的原因是，NPM1蛋白主要通过P53发挥作用，而HL-60细胞系中P53为缺失型，故NPM1蛋白在HL-60细胞系中的作用受到一定的限制。目前尚需要通过动物实验及RNA干扰技术，对NPM1在急性白血病中的功能进行进一步验证。此外本研究结果提示NPM1定量水平与NPM1突变无明显相关性，但由于42份原代细胞标本中仅有2例存在NPM1突变，故仍需通过扩大样本量进一步确认NPM1蛋白的表达量是否受NPM1突变的影响。

本项研究初步探讨了NPM1基因表达在急性白血病中的作用，体外实验提示NPM1基因可能发挥原癌基因的作用，主要通过促进细胞进入S期、抵抗凋亡和增强细胞集落形成能力实现，而原代白血病细胞NPM1的定量水平与细胞遗传学分组相关，为以后NPM1蛋白是否能够作为白血病监测和治疗的靶标提供了新的思路和研究方向。

Funding Statement

基金项目：天津市应用基础与前沿技术研究计划（16JCQNJC12200）；天津市血液病临床医学研究中心建设（15ZXLCSY00010）；中国医学科学院医学与健康科技创新工程（2016-I2M-1-001、2016-I2M-3-004）

Fund program: Tianjin Research Program of Application Foundation and Advanced Technology（16JCQNJC12200）; Tianjin hematology clinical medicine research center construction（15ZXLCSY00010）; CAMS Initiative for innovative Medicine（2016-I2M-1-001、2016-I2M-3-004）