单倍型造血干细胞联合第三方脐血干细胞移植治疗重型再生障碍性贫血127例临床观察

Abstract

Objective

To evaluate the outcome of combination of haploidentical donor (HID) hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) with an unrelated cord blood unit for severe aplastic anemia (SAA).

Methods

The clinical data of 127 SAA patients [including 74 male and 53 female patients, 65 very severe aplastic anemia (vSAA), the median age as 23.5(3–54) years] received HID-HSCT from September 2011 to April 2017 were analyzed retrospectively. The median interval from SAA diagnosis to transplantation was 2 (0.5–180) months. The conditioning was modified Bu/Cy+ATG/ALG-based (Busulfan + cyclophosphamide + antithymocyte immunoglobulin/antilymphocyte immunoglobulin) regimen. Cord blood units were selected based on the results of HLA typing and cell doses evaluated before freezing. Units with at least 4/6 matched HLA loci became the candidates. Prophylaxis for graft-versus host disease (GVHD) was by cyclosporine (CsA), mycophenolate mofetil (MMF) plus short-term methotrexate (MTX).

Results

The median values of absolute nucleated cell counts were 10.87 (3.61–24.00)×10⁸/kg in the haploidentical grafts and 2.22 (1.10–7.30)×10⁷/kg in the cord blood units, respectively. The median doses of CD34⁺ cells infused were 3.49(1.02–8.89)×10⁶/kg in the haploidentical grafts and 0.56 (0.16–2.27)×10⁵/kg in the cord blood units, respectively. Of the 127 patients, 5 patients occurred early death, one patient occurred primary graft failure. All 121 surviving patients attained complete haploidentical engraftment. The median durations of myeloid engraftment were 11 (9–28) days and 15 (9–330) days for platelets, with a cumulative platelet engraftment incidence of 96.1%. The incidence of infection was 58.27% (74/127). During a median follow-up of 20.5 (4–60) months, the incidence of grade Ⅱ–Ⅳ acute GVHD was 24.79% (30/121), moderate-severe chronic GVHD was 14.15% (15/106), 4-year estimated overall survival was (78.5±4.3) %, 4-year estimated failure-free survival was (77.4±4.3) %, respectively.

Conclusion

Combination of HID-HSCT and an unrelated umbilical cord blood unit was a feasible choice with favorable outcome for SAA patients without matched donors.

重型再生障碍性贫血（SAA）是一种致命的骨髓造血衰竭综合征，造血干细胞移植是治疗SAA的重要方法[1]–[2]。SAA的一线治疗包括HLA相合同胞供者异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）和免疫抑制治疗（IST）。年龄<35岁、有HLA相合同胞供者的SAA患者可选择allo-HSCT作为一线治疗。年龄35~50岁的SAA患者可以根据个人意愿、治疗中心的技术水平在HLA相合同胞供者allo-HSCT和IST之间进行选择[2]–[3]。年龄小于50岁初诊SAA患者，如无同胞全相合供者，在有经验的移植中心可以在患者及家属充分知情条件下尝试其他替代供者移植[4]。单倍型造血干细胞移植（haplo-HSCT）作为重要的替代供者移植类型，在SAA的治疗中显示出较好的疗效[5]–[6]。本中心应用haplo-HSCT联合第三方脐血干细胞移植治疗恶性血液病并获得成功[7]，在此基础上，我们将haplo-HSCT联合第三方脐血干细胞移植用于治疗SAA患者，报告如下。

病例与方法

1．病例资料：本回顾性研究纳入2011年9月至2017年4月在苏州大学附属第一医院血液科接受haplo-HSCT联合第三方脐血干细胞移植的127例SAA患者，诊断标准符合文献[2]。男74例，女53例，儿童（<14岁）20例，成人95例，中位年龄23.5（3~54）岁，65例为极重型再生障碍性贫血（VSAA）。全部127例患者中26例（20.47%）为IST无效[环孢素A（CsA）治疗无效12例，抗胸腺细胞球蛋白（ATG）/抗淋巴细胞球蛋白（ALG）联合CsA治疗无效14例]。12例伴有阵发性睡眠性血红蛋白尿（PNH）克隆。诊断至移植中位时间为2（0.5~180）个月。脐血根据冻存前有核细胞数（TNC）及HLA相合程度选择，供受者间HLA≥4/6个位点（HLA-A、B、DRB1位点血清学配型）相合，HLA配型为优先考虑因素。脐血均来自上海脐血库。单倍型供者及脐血相合情况见表1。

表1. 单倍型供者及脐血干细胞相合情况.

项目	例数（%）
供受者关系
母亲供子女	36（28.35）
父亲供子女	47（37.01）
子女供母亲	4（3.15）
子女供父亲	5（3.94）
同胞	35（27.56）
供受者性别组合
男供男	44（34.65）
男供女	31（24.41）
女供女	23（18.11）
女供男	29（22.83）
供受者ABO血型相合度
相合	66（51.97）
大不合	26（20.47）
小不合	27（21.26）
大小均不合	8（6.30）
脐血HLA相合情况
4/6	33（25.98）
5/6	65（51.18）
6/6	29（22.83）

2．预处理方案：所有患者均采用改良Bu/Cy+ATG预处理方案：白消安（Bu）3.2 mg·kg⁻¹·d⁻¹×2 d，环磷酰胺（Cy）50 mg·kg⁻¹·d⁻¹×4 d，ATG 2.5 mg·kg⁻¹·d⁻¹×4 d/ALG 20 mg·kg⁻¹·d⁻¹×4 d。

3．GVHD预防：所有患者均采用CsA+霉酚酸酯（MMF）+短程甲氨蝶呤（MTX）预防GVHD。自−9 d开始予以CsA 3 mg·kg⁻¹·d⁻¹持续24 h静脉滴注，维持CsA浓度200~250 µg/L，胃肠道功能正常后改为口服，移植后1年开始逐步减量，疗程根据GVHD情况进行个体化调整。MMF自−9 d开始用药，成人1.0 g/d，儿童0.5 g/d，+30 d开始逐步减量，+60 d减停。短程MTX：+1 d 15 mg/m²，+3、+6、+11 d 10 mg/m²。

4．造血重建及植入评价：外周血中性粒细胞绝对计数（ANC）>0.5×10⁹/L持续3 d为中性粒细胞植入，PLT>20×10⁹/L持续7 d且脱离血小板输注为血小板植入。+7 d开始，采用DNA短串联重复序列（STR）方法检测供、受者嵌合体变化（每周1次），嵌合体中供者成分>95%为完全供者嵌合体（FDC），嵌合体中供者成分占5%~95%为混合嵌合体（MC）。原发性植入失败：+28 d后ANC<0.5×10⁹/L且至少2次骨髓未检出供者成分。

5．对症支持治疗：①预防肝静脉闭塞症（HVOD）：预处理开始至移植后30 d持续应用低剂量肝素钠（PLT<20×10⁹/L时停用）和前列腺素E1。②阿昔洛韦预防单纯疱疹病毒感染。③米卡芬净或伏立康唑预防真菌感染。④口服复方磺胺甲噁唑预防卡氏肺孢子虫感染。⑤采用实时定量聚合酶链反应（PCR）技术监测外周血巨细胞病毒（CMV）DNA拷贝数，阳性者给予更昔洛韦或膦甲酸钠系统治疗。⑥ +7 d开始使用重组人粒细胞集落刺激因子（rhG-CSF）5 µg·kg⁻¹·d⁻¹，至白细胞计数恢复正常2 d停用。⑦输注经30 Gy ⁶⁰Co辐照处理的血制品，维持HGB≥60 g/L、PLT≥20×10⁹/L。

6．随访：采用门诊或电话联系对所有患者进行随访。随访终点为2017年6月30日，存活患者中位随访20.5（4~60）个月。总生存（OS）时间：造血干细胞回输至因任何原因引起死亡的时间。无失败生存（FFS）时间：造血干细胞植入至任何原因引起死亡的时间。

7．统计学处理：应用SPSS16.0软件进行统计学分析。应用Kaplan-Meier生存曲线进行生存分析。

结果

1．移植物细胞数：haplo-HSCT移植物均为骨髓联合外周血干细胞，回输单个核细胞（MNC）中位数为10.87（3.61~24.00）×10⁸/kg，CD34⁺细胞中位数为3.49（1.02~8.89）×10⁶/kg。回输脐血MNC 2.22（1.10~7.30）×10⁷/kg，CD34⁺细胞0.56（0.16~2.27）×10⁵/kg。

2．造血重建及植入：127例患者中5例发生早期死亡，在可评估的122例患者中1例（为ATG+CsA治疗无效者）发生原发植入失败，其余121例患者成功植入，均为单倍型供者造血干细胞植入，STR呈完全嵌合状态。中性粒细胞、血小板植入时间分别为11（9~28）d、15（9~330）d。5例患者发生血小板植入不良。

3．GVHD及其他移植相关并发症：Ⅰ~Ⅳ度急性GVHD发生率为33.89%（41/121），Ⅱ~Ⅳ度急性GVHD发生率为24.79%（30/121），Ⅲ/Ⅳ度急性GVHD发生率为9.09%（11/121）。慢性GVHD发生率为37.74%（40/106），中/重度慢性GVHD发生率为14.15%（15/106）。移植过程中74例（58.27%）发生感染，感染类型包括粒细胞缺乏性感染、败血症、肺部感染、皮肤软组织感染、肛周感染、泌尿系感染、病毒血症、上呼吸道感染等。1例患者在移植后19.5个月发生骨髓增生异常综合征（MDS）。在随访期内无复发患者。

4．移植相关死亡：127例患者中死亡23例（其中早期死亡5例），其中11例患者死于GVHD，5例患者死于感染，3例患者死于颅内出血，2例患者死于血栓性微血管病（TMA），1例患者死于植入失败，1例患者死于发生MDS。

5．生存分析：预期4年OS率为（78.5±4.3）%，FFS率为（77.4±4.3）%（图1）。

图1. 127例重型再生障碍性贫血患者单倍型造血干细胞联合第三方脐血干细胞移植后总生存（A）和无失败生存曲线（B）.

讨论

同胞全相合allo-HSCT是SAA重要的一线治疗方法，但因同胞全相合供者的匮乏，单倍型供者已逐渐成为重要的造血干细胞来源。对于无同胞全相合供者的SAA患者而言，近年来haplo-HSCT取得了不错的疗效，国内多中心研究显示：101例对免疫抑制剂治疗无效的SAA患者进行haplo-HSCT，中性粒细胞植入率为100%，血小板植入率为（94.1±0.1）%，3年OS及FFS率与同胞全相合移植相比差异均无统计学意义（89%对91%，P=0.555；86.8%对80.3%，P=0.659）[5]。在初诊SAA患者中亦显示出相似结果，haplo-HSCT与同胞全相合移植在植入率（97.8%对97.1%，P=0.528）、3年OS（86.1%对91.3%，P=0.358）及3年FFS（85.0%对89.8%，P=0.413）方面差异均无统计学意义[6]。

植入失败及GVHD是SAA患者进行allo-HSCT面临的主要问题。当前，haplo-HSCT治疗SAA的预处理尚无统一方案。以往研究结果显示改良Bu/Cy+ATG的预处理方案可获得稳定的造血重建[5]。如何降低SAA患者haplo-HSCT后GVHD发生率对于提高长期生存率及生存质量具有重要意义，是当前的研究热点之一。Liu等[8]应用haplo-HSCT联合间充质干细胞移植治疗44例SAA患者，预处理方案为改良Bu/Cy+ATG，3例发生早期死亡，41例可评估的患者中40例（97.6%）成功植入，粒系植入中位时间为12（8~21）d，血小板植入中位时间为19（8~154）d，Ⅱ~Ⅳ度急性GVHD发生率为29.3%，慢性GVHD发生率为14.6%，存活患者中位随访12.0（0.9~30.8）个月，OS率为77.3%。近些年来，降低GVHD发生率的方法（去除T细胞的haplo-HSCT、移植后应用大剂量Cy、联合应用免疫抑制剂等）被相继报道[9]。

本研究中，我们应用haplo-HSCT联合第三方脐血干细胞移植，发生5例早期死亡，在可评估的122例患者中，除1例患者发生原发植入失败外，其余121例（99.18%）患者均成功植入，Ⅱ~Ⅳ度急性GVHD发生率为24.79%（30/121），中/重度慢性GVHD发生率为14.15%（15/106），预期4年OS率为（78.5±4.3）%，4年FFS率为（77.4±4.3）%，疗效比较理想。在植入成功的患者中均为单倍型造血干细胞植入，未发生脐血植入，可能与单倍型造血干细胞的数量远远高于脐血造血干细胞以及移植物抗移植物效应等因素有关[10]–[11]。目前haplo-HSCT联合第三方脐血干细胞移植的机制尚未阐明，对体内细胞因子水平、造血微环境、植入及GVHD的影响尚需深入研究。

本研究结果显示，对于有强烈移植意愿但缺乏HLA全相合同胞供者的SAA患者，haplo-HSCT联合第三方脐血干细胞移植可以作为有价值的治疗选择。

Funding Statement

基金项目：江苏省科教兴卫工程-临床医学中心（ZX201102）；江苏省血液病临床医学研究中心（江苏省科技厅生命健康专项—BL2012005）；国家临床重点专科建设项目、江苏省创新能力建设专项（BM2015004）

Fund program: The Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions (PAPD), Jiangsu Province's Key Medical Center (ZX201102)；The Network Hospital of Clinical Medicine Science and Technology Project, Jiangsu Science and Technology Department (BL2012005); Innovation Capability Development Project of Jiangsu Province (BM2015004)