同种异基因CAR-T细胞治疗复发/难治多发性骨髓瘤四例临床观察并文献复习

Abstract

目的

探讨同种异基因CAR-T细胞治疗复发/难治型多发性骨髓瘤（RRMM）的安全性和有效性。

方法

采集HLA不全相合健康供者外周血淋巴细胞制备CAR-T细胞治疗4例RRMM患者，男1例、女3例。细胞来源3例为亲缘间HLA半相合供者，1例为HLA完全不合的无血缘供者。4例RRMM患者经FC方案（氟达拉滨+环磷酰胺）预处理后进行CAR-T细胞的回输，第0天回输CART-19细胞1×10⁷/kg、第1~2天分别回输CART-B细胞成熟抗原（BCMA）细胞4.7（4.0~6.8）×10⁷/kg的40%和60%（例4于第4天回输CART-BCMA细胞的60%）。

结果

4例RRMM患者完成了CAR-T细胞输注后，CAR-T细胞在患者体内中位扩增2.20（1.93~14.01）倍，中位存活时间为10（8~36）d；根据IMWG疗效标准，2例达部分缓解（PR）、1例为微小缓解（MR）、1例为疾病稳定（SD）。不良反应包括血液学和非血液学不良反应，≥3级血液学不良反应2例、≥3级细胞因子释放综合征（CRS）1例、1级CAR-T治疗后急性反应期的中枢神经系统并发症（CRES）1例，3例患者出现APTT延长、1例患者出现肿瘤溶解综合征，1例检测到STR为混合嵌合状态，临床判断出现GVHD。无进展生存时间为4（3~5）周、总生存时间为63（3~81）周。

结论

小样本研究显示同种异基因CAR-T细胞治疗RRMM可能会出现GVHD；回输后早期有临床反应，但疗效不能维持。同种异基因CAR-T细胞在体内扩增倍数低，持续时间短，可能是影响疗效持久的主要因素。

蛋白酶体抑制剂、免疫调节剂以及造血干细胞移植的应用提高了多发性骨髓瘤（MM）的缓解率和缓解深度，并延长患者生存时间，但其最终仍会复发[1]–[2]。嵌合抗原受体T细胞疗法（CAR-T）是一种新兴的细胞免疫疗法，借助特异的靶抗原识别肿瘤细胞，进而杀伤和消灭肿瘤[3]。目前国内外针对MM的CAR-T细胞主要由患者自身的T淋巴细胞制备[4]–[7]，但部分复发难治MM（RRMM）患者在复发进展阶段的T细胞功能极差[8]，难以制备CAR-T细胞。至今，国内外尚未见采集正常供者淋巴细胞制备CAR-T细胞治疗RRMM的正式报道，现将我中心临床试验中采用同种异基因CAR-T细胞治疗4例RRMM患者的临床资料总结如下，并进行文献复习。

病例与方法

1．病例：病例为2016年12月至2018年2月CAR-T临床试验（NCT03196414）入组患者，4例RRMM患者由于自身T淋巴细胞采集或CAR-T制备失败，进行了正常供者来源的T淋巴细胞制备的CAR-T细胞治疗。诊断符合文献[9]的标准。研究经我院伦理委员会批准[批件号：（2016）伦审批第035号]，并获患者本人及家属知情同意。

2．主要的实验室方法：①MM分型分期相关实验方法同文献[10]；②靶抗原表达的检测：采用FACS Calibur型流式细胞仪（美国Becton Dickinson公司产品）间接免疫荧光法检测肿瘤细胞的表面抗原；③HLA配型分析：采用高分辨基因分型方法检测供受者的HLA-A、B、Cw、DRB1和DQB1位点；④细胞因子释放综合征（CRS）评估：采用Th1/Th2/Th17细胞因子试剂盒（美国BD公司产品）检测IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ和IL-17A共7种细胞因子评估CRS反应，不良反应参考文献[11]标准以及CTCAE 4.03进行评价与分级；⑤CAR-T细胞在体内的扩增情况检测：Q-PCR方法扩增外周血单个核细胞DNA样本，以检测CAR-T细胞在体内的扩增情况；⑥供受者嵌合情况监测：通过短串联重复序列（STR）来检测供受者的嵌合状况。

3．CAR-T治疗方案：例1~3采集HLA位点5/10相合的亲缘供者淋巴细胞，例4采集完全不合（HLA位点0/10相合）的无血缘供者淋巴细胞。经3~4周的CAR-T细胞制备完成冻存备用。患者经FC方案（氟达拉滨30 mg/m²，−5~−3 d；环磷酰胺300 mg/m²，−5~−3 d）预处理后，在第0天回输CART-19细胞1×10⁷/kg，第1~2天回输的CART-B细胞成熟抗原（BCMA）细胞中位数为4.7（4.0~6.8）×10⁷/kg，第1天和第2天依次分40%和60%输注，期间密切观察患者的临床表现，同时监测患者的血常规、生化、细胞因子、凝血等相关指标，并对疗效和安全性进行评估。

4．随访：CAR-T治疗后对不良反应和疗效进行密切的定期观察。通过门诊复查及电话联系进行随访，随访截止日期为2019年2月28日，CAR-T治疗当天起开始随访，中位随访时间为63（3~81）周。回输后第7天第1次复查疗效，3个月内每月复查1次，随后每3个月复查1次，1年之后每6个月复查1次。

结果

4例患者的临床特征见表1。4例患者在接受CAR-T临床试验前均为临床侵袭性复发，其中3例曾接受自体造血干细胞移植，2例伴有髓外侵犯。MM细胞表面BCMA的表达均在50%以上，而CD19表达均为阴性。CAR-T细胞回输及治疗后的临床反应见表2，不良反应见表3。4例患者的详细治疗经过如下：

表1. 4例复发难治多发性骨髓瘤患者CAR-T治疗前的临床特征.

例号	性别	年龄（岁）	M蛋白类型	CAR-T治疗前遗传学异常	复发类型	骨髓瘤细胞表面BCMA表达（%）
1	女	60	IgG-κ	1q21扩增、t（4;14）	侵袭性	55.7
2	男	58	IgA-κ	1q21扩增、复杂异常	侵袭性	94.6
3	女	48	IgG-κ	1q21扩增	侵袭性	88.0
4	女	53	IgG-λ	未查	侵袭性	55.1

注：CAR-T：嵌合抗原受体T细胞；BCMA：B细胞成熟抗原

表2. 4例复发难治多发性骨髓瘤患者CAR-T治疗情况.

例号	CAR-T回输量		CAR-T在体内情况		CRS/CRES分级	临床反应		转归
	CART-CD19	CART-BCMA	扩增倍数	持续时间（d）		最大疗效	持续时间
1	1×107/kg	6.8×107/kg	14.01	36	2/1	部分缓解	4周	第53周死于疾病进展
2	1×107/kg	4.8×107/kg	1.93	10	3/0	部分缓解	5周	第73周死于疾病进展和重症感染
3	1×107/kg	4.6×107/kg	2.25	8	1/0	微小缓解	4周	随访81周仍存活
4	1×107/kg	4.0×107/kg	2.15	10	2/0	疾病稳定	3周	第3周死于多脏器功能衰竭

注：CAR-T：嵌合抗原受体T细胞；BCMA：B细胞成熟抗原；CRS：细胞因子释放综合征；CRES：CART治疗后急性反应期的中枢神经系统并发症

表3. 4例复发难治多发性骨髓瘤患者CAR-T治疗的不良反应.

例号	4级不良反应	3级不良反应	2级不良反应
1	发热、淋巴细胞减少、血小板减少	白细胞减少、中性粒细胞减少、血红蛋白减少	头晕、乏力、肌肉酸痛、恶心呕吐、心动过速
2	淋巴细胞减少	白细胞减少、中性粒细胞减少、血红蛋白减少、血小板减少、低氧血症、肿瘤溶解综合征	发热、恶心、乏力和肌肉酸痛、心动过速、肌酐升高、低血钾
3	中性粒细胞减少、淋巴细胞减少	白细胞减少	血红蛋白减少、血小板减少、发热
4	白细胞减少、中性粒细胞减少、淋巴细胞减少、血红蛋白减少、血小板减少、胆红素升高	发热、转氨酶升高、心动过速、乏力和肌肉酸痛	肌酐升高、恶心呕吐

注：CAR-T：嵌合抗原受体T细胞

例1于2013年5月确诊为伴t（4;14）异常的MM（IgG-κ型，D-S分期Ⅲ期A组，ISS分期Ⅱ期，R-ISS分期Ⅱ期），先后经硼替佐米、来那度胺、泊马度胺、卡非佐米、环磷酰胺、美法仑等药物治疗，在病程第48个月时再次出现临床复发，入组CAR-T临床试验。治疗前HGB 64 g/L，骨髓涂片瘤细胞占80%，骨髓异常单克隆浆细胞表达BCMA为55.7%，CD19阴性。血清学评估M蛋白为20.3 g/L，受累的κ轻链定量为307.5 mg/L。X线显示左侧第5肋骨新发骨质破坏。患者于2017年6月开始回输其5/10相合胞弟来源的CAR-T细胞，回输CART-CD19后约30 h患者开始出现发热，波动于38.0 °C~39.5 °C，5 d后消退，期间收缩压较基础水平最高下降10~15 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa），需要0.1~0.3 µg·kg⁻¹·min⁻¹去甲肾上腺素短暂支持，且出现了主要表现为计算能力下降的1级CAR-T治疗后急性反应期的中枢神经系统并发症（CRES），热退后血压恢复。回输后7 d M蛋白下降52.2%，达部分缓解（PR），疗效持续4周后疾病再次进展，于第53周死于疾病进展。

例2于2010年12月因“腰背酸痛”确诊为MM（IgA-κ型，D-S分期Ⅲ期A组，ISS分期Ⅱ期，R-ISS分期Ⅱ期），经硼替佐米为主方案达非常好的部分缓解（VGPR），后行自体造血干细胞移植，移植后多次疾病进展，先后使用共5种治疗方案控制。在2017年6月再次进展，入组CAR-T临床试验。采集其儿子HLA位点5/10相合的外周血T淋巴细胞制备CAR-T细胞并回输，回输CART-CD19细胞约14 h时开始出现发热，回输后第2天血压下降，需要0.5~1.0 µg·kg⁻¹·min⁻¹去甲肾上腺素维持，后出现脉氧下降、肿瘤溶解综合征等临床表现。经利尿、退热等对症处理后发热消退，临床改善，综合评估CRS反应3级。回输后7 d评估疗效为PR（M蛋白下降60.5%），疗效持续5周后疾病进展，后给予美法仑、CD38单克隆抗体等挽救治疗。第73周死于疾病进展和重症感染。

例3于2015年4月因“头晕乏力伴右肋部疼痛”确诊为MM（IgG-κ型，D-S分期Ⅲ期A组，ISS分期Ⅱ期，R-ISS分期Ⅱ期），硼替佐米为主方案诱导化疗后行自体造血干细胞移植，移植后20个月疾病进展，先后经DT-PACE（地塞米松+沙利度胺+阿霉素+顺铂+环磷酰胺+依托泊苷）和来那度胺治疗，疾病再次进展，肋骨有新发病灶，MM细胞表面BCMA表达88%。FISH示1q21扩增阳性。于2017年9月入组CAR-T临床试验，回输其女儿HLA位点5/10相合外周血来源的T淋巴细胞制备的CAR-T细胞。在回输CART-CD19后26 h出现发热，最高达39.5 °C，持续1.5 d后热退，期间血压、脉氧、肝肾功能和凝血功能均在正常范围内，评估CRS反应1级。回输后7 d评估疗效为最小缓解（MR）（M蛋白下降32.1%），疗效持续4周复查疾病进展，后行美法仑等药物挽救治疗，随访至2019年2月28日仍存活。

例4于2015年6月因“右侧颞部肿胀疼痛伴右眼球突出”就诊，确诊为MM（IgG-λ型，D-S分期Ⅲ期A组，ISS分期Ⅲ期，R-ISS分期Ⅱ期）伴髓外浸润，经硼替佐米一线诱导化疗达VGPR，2016年2月行自体造血干细胞移植，移植后18个月疾病进展，经DECP（地塞米松+环磷酰胺+依托泊苷+顺铂）和MPT（沙利度胺+美法仑+泼尼松）方案达VGPR，2017年11月再次疾病进展并伴有肾功能损害，调整为Rd（来那度胺+地塞米松）方案治疗，疾病未能控制。CT显示右侧眼眶内视神经上方长径约7 mm的异常信号结节、左肺下叶1.8 cm×1.1 cm软组织团块影、胃体小弯侧2.8 cm肿块，胰腺体部1.4 cm×1.1 cm占位、脾中下部近脾门处13.7 cm×6.4 cm占位，均考虑为髓外侵犯；胸腹盆腔少-中等量积液。M蛋白43.03 g/L、λ轻链282.5 mg/L。MM细胞表面BCMA表达为55.1%，CD19阴性。2018年1月入组CAR-T临床试验。FC（氟达拉滨+环磷酰胺）方案预处理后输注CART-CD19，约8 h患者即出现高热（39.7°C），予非甾体类消炎药对症退热处理，第1天输注CART-BCMA（总量的40%），由于患者高热不退和肌酐上升，待第4天肌酐下降后于回输剩余60%的CART-BCMA细胞。回输后球蛋白逐步下降，但出现肌肉骨骼酸痛，天冬氨酸转氨酶、乳酸脱氢酶、胆红素和肌酐指标恶化；第7天复查血清学指标M蛋白下降72.67%，但腹部B超提示髓外侵犯肿块未见明显缩小，STR为25%，初步评估疗效为疾病稳定。患者持续发热，IL-6、C反应蛋白（CRP）升高，结合肝肾功能CRS综合评估为2级。加用甲泼尼龙干预，第12天STR达60%，患者自动出院，第3周死于多脏器功能衰竭。

讨论及文献复习

自体CART-BCMA细胞治疗RRMM已经显示有杀伤骨髓瘤细胞的作用[4]–[7]，Graff等[12]曾报道CART-CD19对瘤细胞表面CD19表达极低的MM患者也有一定的临床疗效。有研究表明MM患者中部分CD19⁺ B细胞具有与克隆浆细胞类似的分子学改变，推测其可能也起着骨髓瘤干/祖细胞的作用[13]–[14]，为尽可能清除不同克隆的MM细胞，我中心在国际上最早尝试应用针对CD19和BCMA两种靶点的自体CAR-T细胞联合输注治疗RRMM，小样本的数据显示总有效率达100%[15]，中位随访19个月，57.1%的患者获得了VGPR以上的持续疗效。但在上述研究中遇到部分RRMM患者自身的T淋巴细胞增殖功能较差，难以培养出足量合格的CAR-T细胞去实施自体CAR-T治疗。我中心在上述联合输注的方案下首次进行了同种异基因CAR-T细胞治疗RRMM的临床观察研究。

本研究中观察到同种异基因CAR-T治疗RRMM的不良反应在多个方面类似于自体CAR-T，如发热、细胞因子上升、肝肾毒性、凝血异常以及血液学毒性[4]–[7]；主要不同且需要关注的是导入CAR的T细胞上的TCR是否会介导GVHD。Brudno等[16]曾报道异基因造血干细胞移植术后复发的20例B系肿瘤患者行CAR-T治疗的结果，均是从原供者外周血采集T细胞制备CART-CD19，在CAR-T输注后没有发现GVHD，推测可能因为移植受者已经耐受了从供者采集的细胞。但近来Hu等[17]发现异基因移植后复发B-ALL患者使用受者体内或原供者来源的CAR-T细胞，21.4%（3/14）发生急性GVHD。本组例1~3未观察到明显GVHD表现，STR均在5%以下。但例4在回输后持续出现发热，回输后第10天胆红素进行性升高，且监测外周血STR呈嵌合趋势（达到60%），判断发生了GVHD。该例系多药耐药、髓内髓外全面复发的患者，处于重度免疫抑制状态。且使用了含氟达拉滨的预处理，该患者3 d内输注的CART-CD19和CART-BCMA细胞，制备时的转染效率分别为32.5%和46.0%，输注物未经CAR-T细胞的纯化，提示患者接受的输注物中含有总T细胞共约7.23×10⁹，即1.2×10⁸/kg，说明CAR-T的回输物中实际上存在较多的未经处理的多克隆T细胞，我们推测可能是造成其混合嵌合状态的原因之一，进而导致其肝肾功能损害。但由于患者很快脏器衰竭死亡，未能进一步动态监测确认其最终的嵌合程度以及活组织病理结果以证实。

同种异基因环境中，由于TCR和CAR抗原同时存在。在特定的T细胞表面TCR丰度可能比CAR更多，T细胞可能更倾向于天然的TCR信号传导，导致了TCR优势[18]。TCR信号的主导地位可能导致增加GVHD并削弱CAR介导的抑制物抗白血病（GVL）效应。导入CAR的异源T细胞，输注到患者体内，也可能发生TCR和CAR的双激活情况，但易被很快耗竭[8]；也有可能是因为受者对供者细胞产生了排斥反应，从而影响了临床应答。目前已报道的自体CAR-T治疗RRMM的总有效率为20%~100%，中位的疗效持续时间达4~15个月不等[4]–[7],[15]。本研究中提示健康供者来源的同种异基因CAR-T治疗RRMM患者早期起效迅速，总有效率类似，但疗效的深度及维持时间明显劣于自体CAR-T治疗的疗效[4]–[7]。Hu等[17]也报道了异基因CAR-T在体内扩增峰值劣于自体CAR-T。该研究中的同种异基因CAR-T回输后可能迅速被耗竭从而影响了CAR-T细胞在体内的扩增倍数以及持续时间，进而导致了弱且短暂的临床疗效。

为尽量控制和减少同种异基因CAR-T治疗引起的GVHD反应，许多学者一直在进行着大量的尝试[19]，具体的措施包括：①增加T细胞的转染效率或改造CAR结构，同时在回输前对CAR-T细胞进行分选，控制总T细胞以及CAR-T细胞的有效输注剂量；②利用病毒特异性T细胞（VST）制备CAR-T可以筛选不含有同种异基因TCR的T细胞，而且在CAR-T细胞过继免疫后使用疫苗（如水痘带状疱疹病毒疫苗）的方法刺激T细胞的扩增，目前已开展有自体抗GD2 CAR-T细胞临床试验（NCT01953900）；③利用抗原刺激后的记忆T细胞进行CAR转导：在小鼠模型中，记忆T细胞被证明有更低的GVHD发生率，一些临床试验（NCT02051257、NCT01815749、NCT02146924、NCT2153580、NCT01318317、NCT 01475058）正在选用中央记忆T细胞制备CAR-19用于B-NHL和B-ALL的治疗；④由于γδT细胞具有较低的排异反应且能介导抗肿瘤效应，有学者尝试在体内或体外扩增γδT细胞，将其用于CAR-T的制备，在此研究领域，尤其是高效筛选分泌IFN-γ型γδT细胞更具应用前景；⑤通过核酸酶，如锌指核酸酶、转录激活因子样效应物核酸酶和CRISPR/Cas9系统敲除等基因编辑技术，制备选择性删除内源性TCR而只表达特异性CAR的T细胞，也可以通过基因编辑技术去除MHC-Ⅰ类分子从而改善CAR-T细胞在不同机体内环境中的持久性。内源性TCR的缺乏消除了GVHD的可能性以及潜在的TCR受体信号干扰[20]。但上述探索多限于临床前研究和Ⅰ期的临床试验阶段，故尚需进一步临床观察评价其可行性。

总之，由于RRMM疾病本身存在的免疫抑制状态及前期多次的治疗，造成此类患者的T细胞数量减少或功能缺陷，难以实施自体CAR-T的挽救治疗。使用供者来源的细胞，尤其是现成的T细胞制备通用CAR-T是未来的趋势。小样本病例观察发现直接导入CAR的异源T细胞治疗未移植或自体造血干细胞移植后的RRMM，疗效短暂且有发生GVHD的可能，临床应用需谨慎。目前已采用多种技术以避免出现GVHD和供者细胞被排斥，提高其治疗的安全性和疗效。也非常有必要透彻地研究TCR/CAR的相互作用，以及内源性TCR敲除是否会影响CAR-T治疗效果。这种即用型细胞制品也使需要的患者减少了等待制备的时间，降低了成本，从而使更多的MM患者从CAR-T治疗中真正获益。

Funding Statement

基金项目：江苏省自然科学基金（BK20160342、BK20161205）

Fund program: Natural Science Foundation of Jiangsu Province（BK20160342, BK20161205）