N-cadherin表达下调对THP-1细胞增殖、凋亡和药物敏感性的影响及机制研究

神经钙黏蛋白（N-cadherin）是经典的钙黏蛋白超家族成员之一，表达于神经细胞、内皮细胞、肌肉细胞和造血干细胞在内的多种正常组织中。它不仅是胚胎发育过程中原肠胚形成和神经嵴发育的重要分子，而且在结直肠癌、前列腺癌、胃癌、乳腺癌等实体肿瘤中参与调控肿瘤的浸润和转移、细胞周期和凋亡等病理过程，并与肿瘤的恶性程度和侵袭性呈正相关[1]–[4]。就造血系统而言，N-cadherin作为骨龛的主要细胞成分，参与调控造血干细胞的自我更新能力及维持造血干细胞龛位大小[5]，并且N-cadherin还表达于急性髓系白血病（AML）、急性淋巴细胞白血病（ALL）和慢性髓性白血病（CML）细胞[6]–[8]。更为重要的是，N-cadherin表达于骨髓基质细胞中，介导CML细胞和基质细胞的黏附，导致耐药形成[8]。但N-cadherin对急性白血病细胞生物学特性的影响及机制研究较少。本研究中我们用RNA干扰的方法下调THP-1细胞N-cadherin的表达，观察N-cadherin对THP-1细胞增殖、凋亡和药物敏感性的影响，并在信号转导通路水平探索其机制。

材料与方法

1．材料和试剂：THP-1 HL-60、Jurkat、KG-1a细胞株均来源于中国科学院细胞库。10%胎牛血清、RPMI 1640培养基购自美国Hyclone公司；N-cadherin一抗购自英国Abcam公司；抗Akt、磷酸化（p）-Akt、mTOR、p-MTOR、β-catenin、GSK-3β、c-myc、Bcl-2、β-tubulin一抗购自美国CST公司；抗GAPDH一抗、抗小鼠二抗购自美国Santa公司；地西他滨、阿糖胞苷、硼替佐米、二甲基亚砜（DMSO）购自美国Sigma公司；发光底物试剂盒购自美国Millipore公司；CCK-8检测试剂盒购自日本同仁化学研究所；APC Annexin Ⅴ/PI凋亡检测试剂盒购自美国Biolegend公司。

2．细胞培养：细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中，置于37 °C、5%CO₂、饱和湿度的恒温培养箱内培养，取对数生长期细胞进行实验。

3．人N-Cadherin基因RNAi靶点设计、合成：针对人N-cadherin基因序列设计并合成3个miRNA干扰片段，构建miRNA干扰载体。3条有效靶点序列包括不同序列的miRNA1（5′-TCTGTAGAGGCTTCTGGTGAA-3′）、miRNA2（5′-TATTTCCATCCTGCGCGTGAA-3′）和阴性对照miRNA（5′-CAACTGCAACCGTGTCTGTTA-3′）。以上干扰序列设计合成由上海瑞赛生物技术有限公司完成。

4．慢病毒表达载体pLenti6.3-EGFP-N-Cadherin-miR的构建：将目的基因与目的载体酶切并连接后，进行重组克隆pLenti6.3-EGFP- N-cadherin-miR的菌落PCR鉴定，将菌落PCR呈阳性的质粒进行酶切鉴定，将菌落PCR和酶切鉴定均呈阳性的克隆送测序，并进行序列比对，测序结果提示慢病毒表达载体构建成功。

5．病毒包装：取EP管，加入无血清DMEM培养液，目的质粒与辅助质粒PsPAX2、PMD2G按3∶2∶1加入，按PolyJet™转染试剂说明书操作，将混悬液加入到Lentix-293T细胞，缓慢摇匀后置于37 °C细胞培养箱，12 h时更换培养液，48及72 h收集病毒上清。

6．慢病毒感染THP-1细胞：转染前1 d取对数生长期THP-1细胞，制备细胞悬液，调整细胞密度为1×10⁵/ml，并接种于6 cm培养皿中，37 °C、5%CO₂培养箱培养；加入收集的病毒上清，同时加入终浓度为8 µg/ml的Polybrene增强感染效率。感染24 h后空白对照组和阴性对照组更换完全培养基继续培养；感染48及72 h后分别观察慢病毒上报告基因GFP的表达情况，并拍照记录感染结果。

7．Western blot法检测蛋白表达水平：分别取5×10⁵个细胞，用1 ml预冷1×PBS溶液洗涤细胞，重复3遍，4 °C，2 000 r/min离心5 min（离心半径为10 cm），吸去上清，加入适量预冷1×PBS，再加入适量2×SDS细胞裂解液，吹打均匀，蛋白质变性后，聚丙烯酰胺凝胶电泳及转PVDF膜，50 g/L脱脂奶封闭PVDF膜，置于摇床上室温封闭1 h，弃去封闭液，加入稀释的一抗，室温孵育2 h。N-cadherin、Bcl-2、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、c-myc、GSK-3 β、β-catenin、β-tubulin蛋白抗体稀释比分别为1∶200、1∶500、1∶500、1∶200、1∶200、1∶200、1∶500、1∶500、1∶500、1∶1 500。用封闭液稀释各蛋白一抗对应的二抗（鼠二抗1∶3 000），室温下孵育1 h。洗涤后化学发光显色。GADPH或β-tubulin为内参照。

8．流式细胞术检测细胞凋亡：按APC Annexin Ⅴ/PI凋亡检测试剂盒说明书进行操作，检测细胞凋亡。

9．CCK-8法检测细胞的增殖能力：取对数生长期的THP-1细胞，调整细胞密度为5×10⁴/ml，接种于96孔板中，每孔100 µl，每组设6个复孔，分别在转染第1~5天时，每孔加入10 µl CCK-8，以加入等量细胞培养液和CCK-8溶液但未加细胞的孔作为空白调零孔。混匀后培养箱中继续孵育3 h，置于酶标仪上，在450 nm处测吸光度（A）值。实验重复3次。

10．药敏实验：将THP-1细胞悬液接种于24孔培养板中（2×10⁵细胞/孔），37 °C、5%CO₂培养箱培养。通过不同浓度的药物处理THP-1细胞后，用CCK-8法检测3种药物对THP-1细胞的IC₅₀值，最终确定1 µmol/L地西他滨、6 µmol/L阿糖胞苷、2 µmol/L硼替佐米用于药敏实验。分别将以上浓度的三种药物加入细胞培养板，处理6 h后撤药培养24 h，然后将细胞平均到96孔板中，每孔加入10 µl CCK-8，混匀后培养箱中孵育1~4 h，采用酶标仪检测样品和空白对照在450 nm处的A值。每组设3个复孔，实验重复3次。

11．统计学处理：应用SPSS17.0软件进行统计分析。正态分布数据以均数±标准差表示，组间两两比较应用t检验。以α=0.05为检验标准，P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1．N-cadherin蛋白在急性白血病细胞株的表达及N-cadherin shRNA下调THP-1细胞N-cadherin蛋白的表达：如图1所示，THP-1细胞高表达N-cadhrein蛋白，N-cadherin shRNA转染THP-1细胞48 h后，通过Western blot检测，N-cadherin蛋白的表达明显下降。且N-cadherin RNAi1组干扰效率显著，我们选择RNAi1组作为实验组进行后续检测。

图1. Western blot检测白血病细胞株N-cadhrein表达及慢病毒感染THP-1细胞后N-cadherin蛋白表达变化.

A：细胞株N-cadhrein表达。1：HL-60细胞；2：THP-1细胞；3：Jurkat细胞；4：KG-1a细胞。B：慢病毒感染THP-1细胞后N-cadherin蛋白表达。1：空白对照组；2：阴性对照组；3：RNAi1组；4：RNAi2组

2．下调N-cadherin的表达对细胞增殖的影响：如图2所示，实验组与阴性对照组及空白对照组相比，随着培养时间延长，THP-1细胞的增殖受到明显的抑制，作用3~5 d时差异有统计学意义（P值均<0.05）。

图2. 靶向干扰THP-1细胞N-cadherin基因表达对细胞增殖的影响.

*与空白对照组比较，P<0.05；#与阴性对照组比较，P<0.05。每组设6个复孔，实验重复3次

3．下调N-cadherin的表达对细胞凋亡的影响：如图3所示，慢病毒感染THP-1细胞48 h，空白对照组、阴性对照组、实验组凋亡率分别为（6.23±0.15）%、（15.40±0.17）%、（33.32±0.40）%（P<0.05）。慢病毒感染72 h，各组凋亡率分别为（4.70±0.27）%、（25.32±0.71）%、（37.88±0.49）%（P<0.05）。

图3. 慢病毒感染THP-1细胞48（A）和72 h（B）对细胞凋亡的影响.

4．下调N-cadherin的表达后THP-1细胞对地西他滨、阿糖胞苷、硼替佐米敏感性的变化：如图4所示，慢病毒感染后，THP-1细胞对地西他滨、阿糖胞苷、硼替佐米的敏感性较对照组显著增加（P值均<0.05）。

图4. 靶向干扰N-cadherin表达后化疗药物对THP-1细胞的增殖抑制率.

*与两对照组比较，P<0.05。每组设3个复孔，实验重复3次

5．下调N-cadherin的表达对相关信号通路蛋白表达的影响：如图5所示，干扰THP-1细胞N-cadherin基因表达后，Akt、mTOR蛋白表达变化不大，而p-Akt和p-mTOR表达下降。另外，Bcl-2、c-myc和β-catenin表达均下降，GSK-3β表达升高。

图5. 靶向干扰THP-1细胞N-cadherin表达后相关信号通路蛋白的表达.

1：空白对照组；2：阴性对照组；3：实验组

讨论

本研究采用慢病毒介导的RNA干扰技术靶向干扰人THP-1细胞N-cadherin基因，研究沉默N-cadherin基因对白血病细胞生物学特性及化疗药物敏感性的影响，并初步探讨相关分子机制。

THP-1细胞是由急性单核细胞白血病患者建株的白血病细胞株。该细胞株虽呈悬浮生长，但较易向巨噬样细胞分化而贴壁生长，特别是在某些诱导剂，如佛波醇酯（PMA）诱导下，因而与黏附相关的N-cadherin表达较高。我们发现靶向抑制N-cadherin表达能够抑制THP-1细胞增殖，促进凋亡，增加其对化疗药物的敏感性。Li等[9]敲除食管鳞状细胞癌细胞中N-cadherin，可以使细胞周期停滞于G₀/G₁期、诱导凋亡、降低侵袭能力并在体内抑制肿瘤形成。PI3K/Akt信号通路可以通过促使肿瘤细胞进入G₁期细胞周期检查点，抑制肿瘤细胞增殖[10]。mTOR受Akt调控，在细胞生长和增殖中起关键作用，在肿瘤细胞中Akt过度活化，激活靶蛋白mTOR可引起肿瘤细胞周期加快、G₁期缩短，加速细胞增殖[11]。此外，N-cadherin可以和β-catenin形成复合物[8]，激活Wnt/β-catenin信号通路[8]，上调cyclin D1、c-myc和survivin的表达，调控细胞周期，促进增殖[12]。我们的结果显示沉默N-cadherin基因后，p-Akt、β-catenin表达下调，可能通过使Akt失活，下调mTOR、β-catenin和c-myc的表达导致细胞停滞在G₀/G₁期，抑制细胞增殖。Bcl-2在细胞凋亡过程中起关键性作用，c-myc表达下降可以通过下调Bcl-2和Bcl-xl，上调caspase-3及其下游的多聚腺苷酸二磷酸核糖聚合酶（PARP），促进AML细胞凋亡[13]。本实验中，沉默N-cadherin基因导致THP-1细胞Bcl-2、c-myc表达下调，促进细胞凋亡。

为进一步研究N-cadherin是否影响THP-1细胞对化疗药物的敏感性，我们采用化疗药物阿糖胞苷、地西他滨和硼替佐米进行药敏实验，结果显示：靶向沉默N-cadherin基因后，THP-1细胞对阿糖胞苷、地西他滨和硼替佐米的敏感性显著增加。阿糖胞苷是一种作用于细胞周期S期的嘧啶类抗代谢药，它可以通过下调mTOR依赖的自噬通路增强白血病细胞对阿糖胞苷诱导凋亡的敏感性[14]。Bcl-2基因与白血病细胞耐药也相关，联合应用Bcl-2抑制剂和阿糖胞苷处理细胞，其药物敏感性显著升高[15]。我们的结果显示干扰THP-1细胞N-cadherin的表达导致p-mTOR和Bcl-2表达下降，提示N-cadherin可能通过p-mTOR和Bcl-2影响THP-1细胞对阿糖胞苷的敏感性。地西他滨为去甲基化药物，Wnt/β-catenin信号通路受抑制参与地西他滨对肿瘤细胞凋亡的影响[16]。我们的结果显示干扰N-cadherin的表达后THP-1细胞对地西他滨敏感性增加，且干扰N-cadherin表达后β-catenin表达下降，提示N-cadherin可能通过Wnt/β-catenin信号通路影响THP-1细胞对地西他滨的药物敏感性。硼替佐米是一种蛋白酶体抑制剂，首先用于多发性骨髓瘤的治疗。近来临床和基础研究显示硼替佐米在淋巴瘤、白血病等的治疗方面也有一定应用前景。我们的结果显示干扰N-cadherin表达后THP-1细胞对硼替佐米的敏感性增加。硼替佐米能下调HL-60细胞Bcl-2蛋白的表达，促进HL-60细胞凋亡[17]。在PTEN基因突变型胶质瘤细胞中，由于Akt高水平活化，抵抗Bcl-2抑制剂联合硼替佐米诱导的凋亡，但下调Akt或p-Akt的表达后细胞凋亡明显增加[18]。而多发性骨髓瘤细胞与间充质干细胞共培养时，成纤维细胞活化蛋白通过β-catenin信号通路抵抗硼替佐米诱导的细胞凋亡[19]。我们的结果显示N-cadherin表达下降后Bcl-2、p-Akt表达降低，β-catenin表达增强，可能与干扰N-cadherin表达后THP-1细胞对硼替佐米的敏感性增加有关。

总之，干扰N-cadherin基因表达影响THP-1细胞的细胞周期、凋亡、增殖和对化疗药物的敏感性，其机制可能与N-cadherin影响Akt、mTOR、β-catenin、GSK-3β、Bcl-2和c-myc等信号通路分子的表达或活性改变有关。

Funding Statement

基金项目：国家自然科学基金（81000224、81400108）