抗CD19 CAR-T细胞治疗难治复发B细胞肿瘤10例临床分析

Abstract

目的

探讨抗CD19 CAR-T细胞治疗难治复发B细胞肿瘤的疗效和不良反应。

方法

2015年12月至2017年7月北京大学第三医院血液科收治的10例患者，包括难治复发的急性B淋巴细胞白血病（B-ALL）6例，难治复发的B细胞非霍奇金淋巴瘤（NHL）4例，采用抗CD19 CAR-T细胞治疗后观察治疗效果及不良反应。

结果

输注后第28天进行近期疗效评估，其中6例ALL患者4例（66.7%）完全缓解（CR），1例（16.7%）部分缓解（PR）；总反应率（ORR）为83.3%。3例弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）患者1例达CR。1例套细胞淋巴瘤（MCL）患者大部分病灶消失，亦有顽固病灶呈进展状态。10例患者均发生细胞因子释放综合征（CRS），主要表现为发热；其中1例患者出现中枢神经系统症状，1例患者出现多脏器功能衰竭，经治疗不良反应均治愈。

结论

抗CD19 CAR-T细胞治疗难治复发B细胞血液系统肿瘤有效，不良反应可控。

由于新疗法及新药物的不断涌现，血液系统肿瘤的疗效大大提高，但仍有部分患者会成为难治或复发病例。CAR-T细胞治疗作为一种新的免疫治疗手段，在部分患者中取得了较好的疗效，给复发难治肿瘤患者带来生存希望。我们对在我院接受抗CD19 CAR-T细胞治疗的肿瘤患者进行疗效及相关不良反应分析，以探讨这一新兴技术在临床中的应用。

病例与方法

一、病例资料

选取2015年12月至2017年7月我科收治的难治复发急性B淋巴细胞白血病（B-ALL）和难治复发非霍奇金淋巴瘤（NHL）患者，患者的诊断依据WHO2008年造血与淋巴组织肿瘤分类标准，按临床试验入组及排除标准对患者进行筛选。主要的入组及排除标准：肿瘤细胞表面存在CD19表达；无中枢神经系统白血病；无不可控制或需要静脉药物治疗的真菌、细菌、病毒或其他感染；无重要脏器功能衰竭。B-ALL患者在接受CAR-T细胞治疗前均复查骨髓及流式细胞术免疫分型，白血病细胞免疫分型为CD19阳性；淋巴瘤患者均重新复核病理检查结果，肿瘤细胞免疫组化表型为CD19阳性。入组患者对于临床研究内容完全知情，并签署知情同意书。本研究经我院医学科学研究伦理委员会审批，批号为（2015）医伦审第（182）号，（2017）药伦审第（016-01）号。

二、CAR-T细胞治疗

1．预处理方案：采用FC方案，具体为氟达拉滨25 mg/m²×3 d，环磷酰胺250 mg/m²×3 d。

2．处理流程：患者在回输前第14天，进行外周血淋巴细胞采集，送实验室进行基因修饰；所有CAR-T细胞经上海斯丹赛生物技术有限公司制备，结构式为scFv/CD8/CD137/CD3ζ；使用转录的病毒为慢病毒；回输前第4天患者接受FC预处理方案；回输前1天休息；回输当天予以非激素类抗过敏药物预防过敏反应，主要为吲哚美辛栓及盐酸异丙嗪。

3．检测指标：分别在输注后第1~7、14、21、28天检测血清细胞因子水平；第1、7、14、21、28天检测骨髓肿瘤细胞数；每日检测患者的体温、血常规等变化。同时收集患者一般资料，包括性别、年龄、体重、疾病，接受抗CD19 CAR-T细胞治疗前的治疗情况及肿瘤负荷情况，回输后抗CD19 CAR-T细胞在体内含量变化情况，最终的疗效及生存情况。

三、疗效和不良反应评价

CAR-T细胞输注后第28天时进行近期疗效评估，评估标准采用NCCN指南中疗效评估标准。细胞因子释放综合征（CRS）诊断标准参考Lee等[1]提出的标准，分为4级。其他不良反应的评估采用WHO抗癌药物急性与亚急性不良反应分度标准。

四、随访

全部患者均通过电话和门诊规律随访至2017年7月。失访病例以失访时间为随访终点。开始治疗至疾病进展或任何原因引起死亡的间隔时间为无进展生存（PFS）时间。

五、统计学处理

计量资料采用Kolmogorov-Smirnov对其进行正态性检验，符合正态分布的计量资料采用均数±标准差进行统计描述，不符合正态分布的计量资料，采用M（P₂₅，P₇₅）进行统计描述。计数资料采用例数（%）进行统计描述。

结果

一、临床特征

共有10例患者接受了抗CD19 CAR-T细胞治疗，患者临床特征详见表1。其中男4例，女6例；中位年龄33.5（25~69）岁。ALL 6例、NHL 4例。ALL患者中3例为Ph⁺ B-ALL。NHL患者中3例为弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL），均为非生发中心亚型（non-GCB），1例为母细胞型套细胞淋巴瘤（MCL）。

表1. 10例接受抗CD19 CAR-T细胞治疗患者的临床特征.

例号	性别	年龄（岁）	体重 (kg)	CAR-T治疗前复发次数	确诊到CAR-T治疗时间（月）	肿瘤负荷	疾病类型	回输CAR-T细胞数量(×106/kg)	CAR-T细胞基因转染率(%)	CAR-T细胞回输后第28天治疗效果	最终生存情况	PFS（月）	CRS级别	回输后第30天外周血CAR-T细胞(%)
1	男	26	70	3	58	骨髓原始细胞0.061	Ph+ALL	4.0	20.0	CR	存活	18	3	6.27
2	女	30	58	1	10	骨髓原始细胞0.795	ALL	3.0	45.0	CR	存活	14	4	15.21
3	女	32	56	/	5	骨髓原始细胞0.296	ALL	7.0	45.0	PR	死亡	3	3	7.61
4	男	26	63	1	6	骨髓原始细胞0.767	ALL	1.2	30.0	NR	死亡	1	1	0
5	男	35	50	1	24	骨髓原始细胞0.100	Ph+ALL	7.0	12.0	CR	存活	12	1	5.54
6	女	62	46	2	36	骨髓原始细胞0.265	Ph+ALL	3.1	31.0	CR	存活	2	1	-
7	女	69	65	/	12	难治	MCL	0.3	35.8	PD	死亡	2	1	16.65
8	女	25	57	/	15	纵隔包块	DLBCL	5.0	26.0	PD	存活	1	1	-
9	女	56	61	/	5	>10 cm腹腔包块	DLBCL	6.1	44.2	CR	存活	2	1	<0.01
10	男	68	72	/	6	纵隔包块	DLBCL	4.6	15.0	PD	死亡	1	1	-

注：PFS：无进展生存；CRS：细胞因子释放综合征；ALL：急性淋巴细胞白血病；MCL：套细胞淋巴瘤；DLBCL：弥漫大B细胞淋巴瘤；CR：完全缓解；PR：部分缓解；NR：未缓解；PD：疾病进展；/：难治；-：未检测

10例均为难治复发患者。10例患者中，5例在治疗过程中曾获得完全缓解（CR）后复发，其中1例为第3次复发，1例为第2次复发；其余5例患者在治疗过程中未获得CR，最佳疗效仅为部分缓解（PR），为难治患者。患者从确诊到接受抗CD19 CAR-T细胞治疗的中位时间为11（5~58）个月。

CAR-T细胞治疗前6例ALL患者骨髓原始细胞中位数为0.280（0.061~0.795）。3例Ph⁺B-ALL未见伴发其他染色体异常，余3例ALL患者中，1例为复杂核型，另2例均存在7号染色体易位。3例DLBCL患者中1例存在10 cm以上肿瘤，2例存在纵隔包块；ⅣB期2例、ⅢB期1例；2例适用aIPI评分为中高危组，1例适用IPI评分为高危组。MCL患者MIPI评分亦为高危组。

二、CAR-T细胞制备、回输情况

回输CAR-T细胞总量中位数为4.27×10⁶/kg（0.30×10⁶/kg，6.93×10⁶/kg）。基因转染率中位数为30.51%（12%，45%）。第1个疗程回输时，5例患者分2次回输，其余5例患者均一次性回输。2例患者接受了第2个疗程细胞回输；1例患者至随访结束时共接受5个疗程CAR-T细胞回输。

三、CRS

10例患者均发生CRS，其中1级7例（NHL 4例，ALL 3例），3级2例（均为ALL），4级1例（ALL）。

1．发热：10例患者均出现发热。发热可开始于回输后第1、2天，持续约1周，14 d内体温均恢复正常。3例患者出现持续性高热，予托珠单抗注射液（2例联合地塞米松）治疗后恢复正常。3例患者CAR-T细胞回输后体温及同期IL-6、外周血CAR-T细胞及骨髓原始细胞的变化详见图1。CRS 1~2级组（7例）和CRS 3~4级（3例）组每日最高体温的中位数，在回输后第2~7天内可见明显差异（图2）。患者发热时间与预处理后骨髓抑制时间相重叠。1例患者仅回输当天出现发热，后再未出现发热。

图1. 例1~3患者（A、B、C）CAR-T细胞回输后体温、IL-6、外周血CAR-T细胞及骨髓原始细胞变化情况.

图2. CAR-T细胞回输后不同细胞因子释放综合征（CRS）诊断分组患者每日最高体温中位数变化情况.

2．脏器毒性：1例患者出现失语，发生在回输后第2天，持续约24 h伴持续性高热，予糖皮质激素及托珠单抗注射液多次，逐渐缓解（图1中第1例患者）。1例患者出现心力衰竭、呼吸衰竭、肿瘤溶解综合征伴肾功能衰竭，予升压药物及无创呼吸机辅助呼吸、补液利尿等治疗，并予托珠单抗注射液及地塞米松后，脏器功能均恢复正常水平（图1中第2例患者）。

3．细胞因子水平：对CRS的监测主要是通过监测细胞因子（包括IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、IFN-γ、TNF-α、TNF-β、G-CSF、GM-CSF）水平。发生CRS时IL-6、INF-γ水平明显升高。在不同程度的CRS组中IL-2、IL-10、IFN-γ水平最高值存在差异[1~2级组IL-2最高值为5.0 ng/L（3.8 ng/L，7.0 ng/L），3~4级组3例患者分别为21.9、11.4、20.0 ng/L；1~2级组IL-10最高值为26.7 ng/L（11.0 ng/L，59.2 ng/L），3~4级组3例患者分别为94.7、982.4、134.6 ng/L；1~2级组IFN-γ最高值为35.7 ng/L（16.6 ng/L，911.0 ng/L）；3~4级组3例患者分别为2 446.3、4 419.8、2 332.2 ng/L]。但不同疾病组中仅TNF-α最高值水平差异明显，B-ALL组低于NHL组[B-ALL组中位数为16.05 ng/L（3.95 ng/L，62.45 ng/L）、NHL组中位数为177.40 ng/L（54.18 ng/L，370.00 ng/L）。

4．不同程度CRS组治疗前免疫功能状况：CRS 1~2级组中位回输细胞数量为4.58×10⁶/kg（1.24×10⁶/kg，6.15×10⁶/kg），基因转染率为30%（15%，35%）；CRS 3~4级组3例患者回输细胞数量分别为3.96×10⁶/kg、3.00×10⁶/kg、6.93×10⁶/kg，基因转染率分别为20%、45%、45%。分析不同程度CRS组患者治疗前免疫功能情况，发现CRS 1~2级组中位CD4⁺/CD8⁺细胞百分比为0.68%（0.44%，1.00%），CRS 3~4级组3例患者分别为1.10%、1.58%、1.29%，发生3~4级CRS患者治疗前体内CD4⁺/CD8⁺细胞百分比更高。

四、其他不良反应

1．血液学不良反应：给予FC预处理方案后，1例患者出现3度白细胞减少，无发热，予以观察；1例患者出现3度白细胞减少并发热，予以广谱抗生素治疗；余8例患者均出现4度白细胞减少并发热，按白细胞减少情况给予G-CSF，并予广谱抗生素治疗。血红蛋白虽有一定程度下降，仅3例患者需少量间断输注红细胞（均为ALL）。10例患者均出现血小板减少，其中0度1例、2度2例、4度7例（ALL 4例，NHL 3例），6例需输血小板支持治疗（ALL 4例，NHL 2例）。

2．非血液学不良反应：1例患者出现多脏器功能衰竭（呼吸衰竭、心力衰竭、肝功能异常、肾功能衰竭、肿瘤溶解综合征），予无创呼吸机辅助通气、补液及2种升压药物升压治疗，多种保肝药物治疗，并予床旁血液透析。1周后患者各项指标均恢复正常。余9例患者，未发生明显肝肾不良反应，未观测到明显凝血功能异常。

五、近期疗效

第28天进行近期疗效评估，其中6例ALL患者CR 4例（66.7%），PR 1例（16.7%），总反应率（ORR）为83.3%。NHL患者中，3例DLBCL患者1例达CR，1例MCL患者大部分病灶消失，仅有一处顽固病灶呈进展状态。在B-ALL患者中，有效病例均为前期治疗有效并长期生存的患者；在NHL患者中，所有病例均为前期治疗未缓解病例，而有效病例来自于更早接受CAR-T细胞治疗的患者。

六、远期疗效

10例患者中，4例死亡（2例B-ALL、1例MCL、1例DLBCL），6例存活（4例B-ALL、2例DLBCL）。存活的4例B-ALL患者中，2例接受allo-HSCT，1例予以反复CAR-T细胞治疗，至随访结束已进行5个疗程CAR-T细胞输注，再次达到PR，1例仅随访2个月。4例死亡患者3例为CAR-T细胞治疗无效患者，最终疾病进展死亡；1例近期疗效评估为PR，后疾病进展，再次予CAR-T细胞输注仍无效，最终疾病进展死亡。无因CRS死亡病例。

讨论

CAR-T细胞治疗已广泛应用于临床[2]，文献报道在ALL中CR率为88%[3]，在NHL中CR率为57.1%（4/7）[4]。本研究中ALL有效率为83.3%，NHL有效率为33.3%。接近文献报道水平。NHL的有效率较ALL低，考虑与NHL存在实体瘤块，CAR-T细胞不易进入有关[5]。目前日本已研发出新型CAR-T细胞[6]，可进入肿瘤组织内，并诱导机体本身T细胞及DC细胞进入肿瘤组织，协同发挥抗肿瘤作用，在多种肿瘤的动物模型中已取得100%疗效。该技术的临床应用或可改善CAR-T细胞在NHL中的疗效。

从CAR-T细胞治疗介入时机来看，本研究中ALL有效病例多出现在前期治疗有效并长期生存的患者。该结果与Kochenderfer等[4]在NHL患者中的研究结果类似。而本研究中的NHL均为难治患者，从发病初到CAR-T细胞治疗前从未达到CR，其中取得较好治疗效果病例均为更早接受CAR-T细胞治疗的患者。推测这可能与患者自身免疫功能状态有关，而这种免疫功能差异可能与不同发病机制有关，并可影响采集及制备的CAR-T细胞功能，亦可影响CAR-T细胞回输后自身免疫系统的调动。

CAR-T细胞回输后，最常见也是潜在最严重的不良反应是CRS。研究显示未发生CRS的患者很难从CAR-T细胞治疗中获益，而发生CRS的患者对CAR-T细胞治疗更容易产生反应[2],[7]–[9]。但是并没有数据表明，CRS的严重程度与CAR-T细胞的治疗效果存在必然相关性，考虑与CAR-T细胞回输前肿瘤负荷等混杂因素干扰有关[10]。Maude等[11]认为CRS的严重程度与回输前肿瘤负荷相关。Lee等[7]提出CAR-T细胞在体内的扩增与临床疗效及CRS的严重程度密切相关。本研究中10例患者也存在CRS严重程度的差异，B-ALL较NHL易发生严重CRS，6例ALL患者中，半数发生3~4级CRS，考虑与CAR-T细胞和肿瘤细胞接触的密切程度有关。但因例数过少，在不同CRS组间无明显疗效差异。对于回输前外周血肿瘤负荷高的第2例ALL患者，回输后确实发生了最严重的CRS，导致多脏器功能衰竭。符合既往文献报道。

发生CRS需有指标进行描述及检测，目前广泛使用的客观指标为细胞因子。Davila等[2]认为IFN-γ、IL-6、IL-5、IL-10、Flt-3L、GM-CSF、Fracktalkine这7个细胞因子水平变化与严重CRS诊断密切相关，并制定出严重CSR诊断标准。本研究中3~4级CRS组患者IL-2、IL-10、IFN-γ最高值均明显高于1~2级CRS组，证实其为观测CRS反应良好的实验室监测指标。同时我们发现在不同疾病组中TNF-α最高值中位数存在差异，因而在现有不同CRS分级标准制定体系中，或可加入不同肿瘤细胞生物学特征及肿瘤免疫系统不同等因素，制定出肿瘤特异性CRS监测指标及分级标准[12]。现在的研究热点在于找到能准确有效区分CRS反应程度的细胞因子，并制定分层诊疗策略[12]–[15]，或便于临床的检测指标（目前多项研究建议使用CRP[2],[7]）；而难点在于预测CRS反应。

我们通过对治疗前患者免疫功能状态的监测发现，治疗前存在更高CD4⁺/CD8⁺细胞百分比患者，治疗后出现CRS的级别亦较高。该项指标或可成为预测CRS反应的指标，有待大规模临床试验的验证。这很容易让人联想到近期采用的CD4⁺∶CD8⁺细胞等比制备CAR-T细胞的方法，研究者认为，如此制备CAR-T细胞再联合利于CAR-T细胞植入的FC方案，可以减少细胞的输注剂量，减少CRS不良反应的发生，但同时可以取得与既往研究相当的治疗效果[16]。CD4⁺∶CD8⁺细胞的等比制备，以及FC方案的植入效果优于环磷酰胺单药，或可间接证明治疗前患者免疫功能状态，影响CAR-T细胞的制备、回输后在体内的扩增及CRS的产生，值得今后给予更多的关注。

CAR-T细胞相关脑病综合征（CRES）也是大家所关注的焦点。其临床表现形式多样，但发病机制仍不明确。Davila等[2]的研究显示，在发生脑病的患者脑脊液中未检测到CAR-T细胞，他们认为CNS反应为T细胞介导的广义的炎症反应，而非CAR-T细胞的直接毒性反应。Maude等[17]2014年报道发生脑病的患者中，脑脊液检测未发现感染及白血病细胞；其2015年的报道显示发生脑病的患者，在脑脊液中可以检测出CAR-T细胞，但不是所有检出患者均发生脑病，所以认为脑病的发病机制不详，且IL-6拮抗剂效果欠佳[10]。我们观察到1例发生CRES的患者，患者否认既往有CNS累及，但治疗前未再检测。在大剂量糖皮质激素及多次托珠单抗治疗下，症状持续24 h后逐渐缓解，因患者配合度差，未能检测发作当时脑脊液情况。已有学者明确提出，脑脊液中可检测出CAR-T细胞，但亦可检测到CNS肿瘤细胞消失[7]。虽然存在严重CRES反应的可能性，但是CAR-T细胞可进入CNS，可成为清除CNS疾病残存的新手段。下一步，或可考虑进行鞘内注射，但其安全性、注射剂量仍待探讨。

综上所述，抗CD19 CAR-T细胞在治疗难治复发B细胞血液系统肿瘤方面具有应用前景，其治疗过程中不良反应可控，安全性良好。对于前期治疗曾达缓解并长期生存的ALL患者推荐使用CAR-T细胞治疗，对于难治的NHL患者，则建议更早介入CAR-T细胞治疗。患者在接受CAR-T细胞治疗前机体免疫功能状态或可预测CRS反应严重级别。