一种新的高亲和力的人源化抗CD19 CAR-T细胞的构建及体外功能验证

Abstract

目的

构建人源化抗CD19嵌合抗原受体T细胞（CAR-T），通过体外实验验证其杀伤白血病细胞的能力。

方法

将人CD19的鼠源抗体（FMC63）进行了人源化改造，获得高亲和力的人源化CD19抗体；构建携带人源化CD19 CAR慢病毒载体，感染T细胞获得人源化CD19 CAR-T细胞（hCART19）；按不同效靶比将效应细胞[hCART19、未转染的T细胞（阴性组）及对照病毒转染的T细胞（对照组）]及靶细胞（CHO-K1-CD19及Raji细胞）混合培养，LDH释放实验及ELISA法检测hCART19杀伤白血病细胞的能力及细胞因子释放水平；白血病小鼠模型检测hCART19的杀瘤效果。

结果

LDH释放实验证实随着效靶比的不断增加，对靶细胞的杀伤率逐渐增加，当效靶比为10∶1时hCART19组的杀伤率最大，在Raji细胞中为（87.56±1.99）%，明显高于阴性组[（19.31±1.16）%]及对照组[（21.35±1.19）%]（P值均<0.001）。ELISA法检测显示Raji细胞作为靶细胞时，hCART19组IL-2水平[（10.56±0.88）pg/ml]及IFN-γ[（199.02±12.66）pg/ml]较阴性组[IL-2：（3.55±0.26）pg/ml；IFN-γ：（37.63±0.85）pg/ml]及对照组[IL-2：（2.92±0.32）pg/ml；IFN-γ：（52.07±3.33）pg/ml]明显升高（P值均<0.001）。以上实验在CHO-K1-CD19细胞作为靶细胞时也出现了相似的结果。给予白血病小鼠模型尾静脉分别注射hCART19、对照病毒转染的T细胞及未转染的T细胞，结果显示hCART19组小鼠存活时间>40 d，另外两组小鼠在20~30 d全部死亡，差异有统计学意义（χ²=11.73，P=0.008）。

结论

成功构建了具有抗白血病活性的人源化CD19 CAR-T细胞，为下一步的临床研究奠定了基础。

CAR-T疗法是目前最有前景的肿瘤免疫治疗技术之一[1]–[2]。尽管全球已有多项针对实体肿瘤细胞表面分子CAR-T的研究报道，但其临床试验的结果仍不尽人意[3]–[5]。而在血液肿瘤领域，多项临床试验均证实CAR-T疗法可有效治疗多种难治复发的B细胞恶性血液病，如急性B淋巴细胞白血病（B-ALL）、慢性淋巴细胞白血病、淋巴瘤等[6]–[9]。现有数据显示抗CD19 CAR-T治疗难治复发B-ALL患者完全缓解（CR）率为70%~90%[10]。白血病细胞的消退与CAR-T细胞的增殖水平及其在血液中的存活时间存在密切相关。而ALL患者体内的CAR-T细胞消失常伴随着正常B细胞的恢复，并且部分患者出现了CD19⁺白血病的复发。多种机制可能造成体内CAR-T细胞的失活，其中之一就是针对CAR结构中来源于鼠源单链抗体（scFv）的，与抗原特异性结合的表位机体产生HLA限制性T细胞介导的免疫应答。利用人源化的scFv有望减低CAR的免疫原性从而改善CAR-T细胞的存活时间并且增强CAR-T的治疗效果。我们针对靶向人CD19的鼠源抗体（FMC63）进行了人源化改造，进而构建了高亲和力的人源化抗CD19 CAR-T细胞，通过体外杀伤实验及动物模型验证其杀伤白血病细胞的作用，现报道如下。

材料与方法

一、材料和试剂

SPF级NOD/SCID小鼠，6~8周龄，由南京生物医药研究院提供；FACS Calilbur流式细胞仪为美国BD公司产品；淋巴细胞分离液、EasySep磁极购自美国Stem Cell公司；Dynabeads Human T-Expander CD3/CD28、CHO-S细胞购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司；X-Vivo 15无血清培养基购自瑞士Lonza公司；Polybrene购自美国Santa Cruz公司；PE标记的抗人IgG抗体、PerCP标记的抗人CD3抗体、APC标记的抗人CD19抗体均购自美国BD公司；IL-2、IL-7、IL-15购自上海普欣生物技术有限公司；人IL-2及IFN-γ ELISA检测试剂盒购自美国R&D公司；乳酸脱氢酶（LDH）细胞毒性检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；Burkitt淋巴瘤细胞系Raji细胞购自美国菌株保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）；Lenti-EF1a质粒、pFUSE-hIgG1-FC2质粒、表达外源人CD19蛋白的CHO-K1细胞（CHO-K1-CD19）及293T细胞为本实验室保存。

二、实验方法

1．人源化CD19抗体的构建：对FMC63鼠源抗体重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）序列进行分析，获取其中的互补决定区（CDR）序列信息。通过国际免疫遗传学数据库（IMGT）比对分析，选择与鼠抗序列相似度最高的人源化抗体框架区，将鼠抗CDR区直接放入人源化抗体框架区。合成人源化的抗体VH和VL序列，并亚克隆至scFv表达载体pFUSE-hIgG1-FC2中，瞬时转染CHO-S细胞，并使用Protein A柱子纯化scFv。

2．流式细胞术（FCM）检测人源化CD19 scFv与靶蛋白的结合能力：1×10⁶ CHO-K1-CD19与10 µg人源化scFv室温孵育30 min，加入2 µg/ml的PE标记的抗人IgG抗体，FCM检测抗体与CD19蛋白的结合能力。

3．携带人源化CD19 CAR慢病毒的制备：选择经FCM鉴定的人源化CD19 scFv的VH和VL序列，与人CD8跨膜区、CD8铰链区、4-1BB、CD3ζ、T2A-EGFRt等序列顺序合成，形成人源化CD19 CAR结构，亚克隆至Lenti-EF1a质粒，按三质粒包装系统操作流程包装携带人源化CD19 CAR的重组慢病毒载体[11]，高速离心后−80°C保存。以Lenti-EF1a空质粒包装的慢病毒载体作为对照病毒。

4．人源化CD19 CAR-T细胞（hCART19）的产生：抽取健康志愿者外周血10 ml，经淋巴细胞分离液密度梯度离心获取单个核细胞（PBMC），利用磁珠分选CD3⁺ T细胞，经CD3/CD28磁珠刺激24 h，按感染复数（MOI）=5加入携带人源化CD19 CAR的重组慢病毒及对照病毒，定期换液培养，7~10 d后获得hCART19及对照病毒转染的T细胞，FCM检测病毒转染效率。

5．体外实验评价hCART19杀伤能力及细胞因子释放能力：以表达CD19抗原的CHO-K1-CD19及Raji细胞作为靶细胞（细胞计数为2×10⁵），未转染的T细胞（阴性组）、对照病毒转染的T细胞（对照组）及hCART19作为效应细胞，按不同效靶比（0.5∶1、1∶1、2∶1、5∶1、10∶1）将效应细胞及靶细胞混合培养，按LDH细胞毒性检测试剂盒说明书进行操作，用酶标仪检测490 nm处吸光度（A）值，计算细胞杀伤率。同时取上清利用ELISA法检测各组细胞的IL-2及IFN-γ分泌能力。

$$杀伤率(\%)=\frac{A_{效应细胞自发释放}-A_{靶细胞自发释放}}{A_{效应细胞自发释放}-A_{靶细胞自发释放}}\times 100\%$$

6．白血病小鼠模型评价hCART19杀伤能力：取15只6~8周龄的NOD/SCID小鼠，每只小鼠尾静脉注射1×10⁶ Nalm6细胞。将15只小鼠随机分为3组，每组5只，分别为阴性组、对照组及hCART19组。在输注Nalm6细胞1周后各组小鼠分别给予尾静脉注射1×10⁶个未转染的T细胞、对照病毒转染的T细胞或hCART19。每日观察小鼠的生存情况，每周通过内眦静脉采血0.2 ml，利用FCM检测外周血CD19⁺细胞比例及CAR⁺细胞比例。

7．统计学处理：每组实验至少重复3次，采用SPSS 16.0软件进行统计学分析。数据符合正态分布，多组数据间比较采用单因素方差分析，组内两组间比较采用LSD-t法，采取Kaplan-Meier法绘制生存曲线，应用Log-rank检验进行组间比较。P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1．高亲和力人源化CD19 scFv的筛选：将IMGT数据库分析构建的不同人源化抗体重链和轻链序列通过（GGGGS）3链随机连接，构成10条人源化CD19 scFv，经真核表达载体表达后纯化出10个人源化scFv（Clone H3L1-H3L10）。FCM检测显示鼠源CD19抗体FMC63其结合CD19抗原的效率为99.5%，而10个人源化CD19 scFv中有两个抗体其结合CD19抗原的效率>90%，分别为Clone H3L1 96.2%，Clone H3L2 98.0%（图1）。选择Clone H3L2抗体序列进行CAR序列的合成。

图1. 流式细胞术检测人源化CD19单链抗体与靶蛋白的结合能力.

2．携带人源化CD19 CAR慢病毒的制备：选择Clone H3L2抗体的VH和VL序列，与人CD8跨膜区、CD8铰链区、4-1BB（CD137）、CD3ζ、T2A-EGFRt等序列顺序合成，形成人源化CD19 CAR结构。构建携带人源化CD19 CAR的慢病毒载体Lenti-CAR-2A-EGFRt（图2），经三质粒系统包装重组病毒及对照病毒，高速离心浓缩后冻存备用。

图2. 携带人源化CD19 CAR的慢病毒载体结构示意图.

scFv：单链抗体；RRE：rev应答元件；AMP：氨苄青酶素；WPRE：翻译后调节元件；EGFRt：截短型表皮生长因子受体

3．hCART19的产生：健康志愿者外周血分选的CD3⁺ T细胞，经感染携带人源化CD19 CAR的慢病毒及对照病毒后，分别获得hCART19及对照病毒转染的T细胞，FCM检测病毒转染效率为58.3%及1.4%（图3）。

图3. 流式细胞术检测携带人源化CD19 CAR的慢病毒转染效率.

hCART19：人源化CD19 CAR-T细胞

4．hCART19的体外杀伤能力：按不同效靶比将效应细胞及靶细胞混合培养，结果显示随着效靶比的不断增加，靶细胞的杀伤率逐渐增加，当效靶比为10∶1时hCART19杀伤靶细胞效率达到最大。其中三组对Raji细胞杀伤率比较差异有统计学意义（F=2 023.81，P<0.001），进一步两两比较显示hCART19组[（87.56±1.99）%]明显高于阴性组[（19.31±1.16）%]及对照组[（21.35±1.19）%]（P值均<0.001）；三组对CHO-K1-CD19细胞杀伤率比较差异有统计学意义（F=4 867.01，P<0.001），两两比较显示hCART19组[（90.60±0.74）%]明显高于阴性组[（24.48±1.01）%]及对照组[（24.95±1.05）%]（P值均<0.001）（图4）。取效靶比10∶1时各组细胞培养上清行ELISA检测，结果显示靶细胞为Raji细胞时三组IL-2水平比较差异有统计学意义（F=171.67，P<0.001），hCART19组[（10.56±0.88）pg/ml]明显高于阴性组[（3.55±0.26）pg/ml]及对照组[（2.92±0.32）pg/ml]（P值均<0.001）；三组IFN-γ水平比较差异有统计学意义（F=417.45，P<0.001），hCART19组[（199.02±12.66）pg/ml]明显高于阴性组[（37.63±0.85）pg/ml]及对照组[（52.07±3.33）pg/ml]（P值均<0.001）。靶细胞为CHO-K1-CD19时三组IL-2水平比较差异有统计学意义（F=1 319.97，P<0.001），hCART19组[（15.03±0.81）pg/ml]明显高于阴性组[（4.72±0.25）pg/ml]及对照组[（5.61±0.39）pg/ml]（P值均<0.001）；三组IFN-γ水平比较差异有统计学意义（F=666.02，P<0.001），hCART19组[（290.66±10.10）pg/ml]明显高于阴性组[（51.43±12.06）pg/ml]及对照组[（55.86±2.38）pg/ml]（P值均<0.001）（图5）。

图4. 不同效靶比人源化CD19 CAR-T细胞（hCART19）对Raji细胞（A）及CHO-K1-CD19细胞（B）杀伤能力测定（***P<0.001）.

图5. ELISA法检测效靶比为10∶1时人源化CD19 CAR-T细胞（hCART19）对Raji及CHO-K1-CD19细胞IL-2（A）及IFN-γ（B）水平的影响（***P<0.001）.

5．hCART19对白血病小鼠生存的影响：阴性组及对照组小鼠在接种Nalm6细胞后20~30 d全部死亡，hCART19组小鼠存活时间>40 d，较另外两组小鼠生存时间差异有统计学意义（χ²=11.73，P=0.008）（图6A）。FCM检测结果显示三组小鼠在注射白血病细胞后14 d（F=154.74，P<0.001）及21 d（F=291.28，P<0.001）外周血中CD19⁺白血病细胞比例差异有统计学意义，其中阴性组小鼠在注射白血病细胞后14 d为（12.24±1.30）%，21 d为（17.15±0.96）%；对照组小鼠在注射白血病细胞后14 d为（10.10±1.05）%，21 d为（20.84±2.22）%；而hCART19组小鼠在注射白血病细胞后14 d为（1.78±0.40）%，21 d为（0.16±0.09）%，明显低于阴性组及对照组（P值均<0.001）（图6B），28 d后已检测不到hCART19组小鼠外周血CD19⁺白血病细胞表达。我们还采用FCM检测了三组小鼠在注射白血病细胞后外周血中CAR-T细胞的比例变化，结果显示未转染的T细胞组小鼠在注射白血病细胞后未检测出CAR-T细胞的存在，而hCART19组小鼠在注射白血病细胞后14 d及21 d分别检测到CAR-T细胞比例为（9.66±1.28）%及（4.38±0.70）%，明显高于对照组小鼠14 d及21 d的CAR-T细胞比例[分别为（0.74±0.38）%及（0.14±0.11）%]（P值均<0.001）（图6C），35 d已检测不到hCART19组小鼠的CAR-T细胞。

图6. 人源化CD19 CAR-T细胞（hCART19）的体内杀瘤效果（***P<0.001）.

A：白血病小鼠的生存时间；B：小鼠外周血中CD19⁺细胞比例变化；C：小鼠外周血中CAR-T细胞比例变化

讨论

CAR-T技术是生物医学近期最重要的创新之一。该疗法在体外通过生物技术改造免疫性T细胞，令其识别癌细胞表面的抗原，达到定向杀死癌细胞的功效。目前大多数CAR由scFv、跨膜区域和胞内信号转染区组成。scFv由来源于单克隆抗体的VH和VL组成，中间由带韧性的铰链区连接形成。scFv可特异性识别肿瘤相关抗原并与之结合，进而将信号传递给胞内信号域激活CAR-T细胞产生杀伤作用，因此是CAR-T疗法成功与否的关键结构。在实体肿瘤方面，2006年Kershaw等[12]首次报道了利用针对FRα抗原的鼠源scFv制备的CAR-T细胞治疗卵巢癌的临床试验结果，该类CAR-T细胞有较好的体外杀伤作用，但输入患者体内却很快耗竭，其持久性很差。2011年Lamers等[5]利用针对CAⅨ抗原的鼠源scFv制备的CAR-T细胞治疗肾细胞癌患者，结果显示大部分患者治疗后出现了针对CAR-T细胞的体液及细胞免疫应答，其中鼠源scFv结构中的CDR及骨架区（FR）序列是引起细胞免疫应答的主要区域，并且该研究证实针对CAR的免疫应答导致了CAR-T细胞在外周血液中的短暂存活，影响了治疗效果。在血液肿瘤方面，目前全球最成功的临床试验结果主要来源于针对CD19的CAR-T治疗。现有的已发表的靶向CD19的临床试验其CAR结构中的scFv主要来源于鼠FMC63或SJ25C1单抗。Turtle等[13]对B-ALL患者输注了利用FMC63来源的scFv制备的等比例CD4⁺ CAR-T及CD8⁺ CAR-T细胞，结果显示93%的患者获得了骨髓缓解，而其中5例白血病细胞持续存在或缓解后复发的患者，再次输注CAR-T细胞均未能产生疗效，经检测证实由于鼠源CAR序列的免疫原性导致了CAR-T细胞无法活化及持续存在。以上研究提示转基因的免疫原性是影响CAR-T体内存活的关键因素之一。

人源化scFv是将鼠源scFv结构中的CDR区保留，而FR区改为人源序列，这一变化将进一步减少人体对CAR序列产生的免疫应答，有望改善并延长CAR-T在体内的存活时间。由于鼠源CAR产生的免疫原性影响了CAR-T细胞在患者体内的存活时间，因此全球多个中心正在进行人源化CAR-T的研制工作，但相关的研究报告极少，且未见人源化CAR-T相关临床试验研究性论文的发表。我们通过将鼠抗人CD19抗体（FMC63）的人源化而获得了与FMC63亲和力相似的人源化的抗CD19抗体。利用人源化抗CD19 scFv与其他序列连接，构建出人源化CAR结构，经慢病毒包装、感染，从而获得了hCART19细胞。体外实验证实hCART19细胞可有效杀伤CD19⁺白血病细胞并分泌大量的IL-2及IFN-γ。在白血病小鼠模型中证实hCART19可有效清除白血病细胞，延长小鼠的生存期。

我们成功构建了具有抗白血病活性的人源化抗CD19 CAR-T细胞，这为下一步的临床试验奠定基础。在今后的临床研究中需要进一步观察该类细胞治疗复发、难治性B细胞肿瘤的安全性、有效性及免疫原性等问题。

Funding Statement

基金项目：国家自然科学基金（81470303）；江苏省社会发展重点项目（BE2017639）；中国博士后基金（2016M591928）；徐州市社会发展计划（KC16SY148）

Fund program: National Natural Science Foundation of China (81470303); Jiangsu Province Social Development Key Projects (BE2017639); China Postdoctoral Science Foundation funded project (2016M591928); Xuzhou Science and Technology Plan Projects (KC16SY148)