血管性血友病（von Willebrand disease, VWD）是临床上常见的常染色体遗传性出血性疾病，是由于血管性血友病因子（von Willebrand factor, VWF）数量减少或质量异常所导致的遗传性疾病，多数为显性遗传，少数为隐性遗传，其发病率约为1/1 000[1]。VWF基因是VWD的致病基因，位于12号染色体短臂末端（12p13.3），包含52个外显子，其mRNA编码2 813个氨基酸前体蛋白（包括22个氨基酸组成的信号肽、741个氨基酸的前体多肽及2 050个氨基酸的成熟亚单位）[2]。VWF基因外显子较多，传统的Sanger测序耗时耗力，我们应用目标序列捕获高通量测序对2例VWD患者进行基因诊断。
对象与方法
一、病例资料
例1，女，3岁，自2岁起出现鼻黏膜破损后出血难止，无发热，无皮肤紫癜，局部压迫止血无效，输注凝血因子Ⅷ（FⅧ）可止血。于当地医院查血常规未见明显异常，FⅧ活性（FⅧ∶C）1.1%，FⅨ活性96.9%。2017年4月至我院就诊，血型B型，FⅧ∶C 1.3%（参考值50%~150%），VWF活性2.1%（参考值48.8%~163.4%），VWF抗原1.8%（参考值50%~160%）。患儿父母非近亲结婚，无类似症状，FⅧ∶C、VWF活性和VWF抗原均正常。
例2，女，11岁，因拔牙后出血难止就诊，血型B型，FⅧ∶C 77.6%，VWF活性5.7%，VWF抗原8.3%。患儿父母非近亲，无类似症状，FⅧ∶C、VWF活性和VWF抗原均正常。
本研究经郑州大学第一附属医院医学伦理委员会批准，所有基因诊断项目均取得患者及家属同意并签署知情同意书。
二、样本采集与DNA提取
采集受试者外周血2 ml，EDTA-K2抗凝。采用美国Omega Bio-tek公司的外周血DNA提取试剂盒提取基因组DNA，并使用分光光度计检测基因组DNA浓度和纯度。
三、目标序列捕获高通量测序
1．文库制备：采用Life Technologies公司的Ion Ampliseq™ Library Kits 2.0文库构建试剂盒制备文库。采用本实验室自行设计的血友病Panel（共179对引物）对2例患者血友病相关致病基因（包括F7、F8、F9、F11、VWF）的所有外显子编码区及侧翼序列进行扩增。采用Ion Xpress™ Barcode Adapters Kit将接头连接至扩增产物并纯化。
2．乳液PCR扩增和磁珠颗粒（ISP）富集：将文库按一定比例稀释，采用Ion PGM™ Hi-Q™ View OT2 Kit和Ion One Touch 2 system对文库进行乳液PCR扩增，然后将产物加入Ion One Touch ES进行磁珠颗粒富集。
3．Ion Torrent PGM平台高通量测序：采用Ion PGM HiQ Sequencing Kit及Ion Torrent 316芯片在Ion Torrent PGM平台进行高通量测序反应，共500个测序循环。
4．数据分析：高通量测序产出数据采用Ion Torrent Suite v5.0软件进行数据比对及变异分析，检索数据库及相关文献，同时应用生物信息学软件PolyPhen-2和SIFT对获得的位点进行致病性预测。
四、PCR及Sanger测序验证
针对例1设计VWF基因第32、43号外显子编码区和剪切区引物，针对例2设计VWF基因第6号、23号外显子编码区和剪切区引物（表1），分别对患者及其父母基因组DNA进行常规PCR扩增，产物送生工生物工程（上海）股份有限公司进行Sanger测序验证。
表1. 血管性血友病因子（VWF）基因外显子引物序列.
| 外显子 | 引物序列（5′→3′） |
产物大小(bp) | |
| 上游引物 | 下游引物 | ||
| 6 | CACCAGCAGACCTAGAATTTTCA | GCGTAAGTCCATTCCTCCCC | 318 |
| 23 | AAGGAAGCTCAGGAATGGGT | CACTCTGTGTCCATACCACCA | 736 |
| 32 | TGTGGTATACACCTCCCATGAA | AACATCTTCCTCATAGGGCTGA | 486 |
| 43 | CCTTCCTAAGATGCCCTCCTC | TTTATTGCCACATTCTCAGCAC | 331 |
结果
一、高通量测序结果
例1携带2个可疑致病突变：第32号外显子c.5557C>T（p.R1853X）杂合突变，第43号外显子c.7332G>A（p.W2444X）杂合突变。例2携带2个可疑致病突变：第6号外显子c.605G>A（p.R202Q）杂合突变，第23号外显子IVS23+5G>A剪切区杂合突变。
针对检测到的变异位点检索Ensemble、HGMD等数据库及Pubmed相关文献，同时进行致病性预测。参考基因组版本为Hg19，VWF基因标准参照序列为NM_000552。经检索，例1 VWF基因c.5557C>T（p.R1853X）为已知致病突变，在HGMD数据库和VWD突变数据库中已有报道[3]；c.7332G>A（p.W2444X）为无义突变，在HGMD数据库及VWD突变数据库中均未见收录，为新的无义突变，Mutation Taster软件预测为致病突变。例2 VWF基因c.605G>A（p.R202Q）为错义突变，在HGMD数据库及VWD突变数据库中均未见收录，PolyPhen-2、SIFT及Mutation Taster软件均预测为致病突变；IVS23+5G>A在HGMD数据库和VWD突变数据库中已有收录[4]–[5]。
二、Sanger测序结果
例1为VWF基因c.5557C>T（p.R1853X）和c.7332G>A（p.W2444X）复合杂合突变，其母携带c.7332G>A（p.W2444X）杂合突变，其父携带c.5557C>T（p.R1853X）杂合突变（图1）；例2为VWF基因c.605G>A（p.R202Q）和IVS23+5G>A复合杂合突变，其母携带IVS23+5G>A杂合突变，其父携带c.605G>A（p.R202Q）杂合突变（图2）。
图1. 例1家系Sanger测序结果（箭头所示为突变位点）.
A：例1及其父亲c.5557C>T（p.R1853X）杂合突变；B：例1及其母亲c.7332G>A（p.W2444X）杂合突变
图2. 例2家系Sanger测序结果（箭头所示为突变位点）.
A：例2及其父亲c.605G>A（p.R202Q）杂合突变；B：例2及其母亲IVS23+5G>A杂合突变
讨论
国际血栓和止血协会（ISHT）将VWD分为1、2、3型[6]。VWF基因突变是VWD最常见的致病机制。在1型VWD患者中，VWF基因突变率为60%~70%[7]，2、3型VWD患者的VWF基因突变率为90%以上[8]–[9]。1型VWD患者的VWF数量减少，功能正常，遗传方式主要为常染色体显性遗传，VWF基因突变类型以错义突变最为常见[10]。2型VWD患者的VWF数量变化不明显，但结构和（或）功能异常。2型又分为2A、2B、2M和2N四个亚型，2A型常表现为染色体显性遗传，少数为常染色体隐性遗传；2B和2M型表现为常染色体显性遗传；2N型表现为常染色体隐性遗传。2型VWF基因突变中错义突变占90%以上。3型VWD患者的VWF完全缺如，多由纯合突变或复合杂合突变导致，临床上符合常染色体隐性遗传规律[11]–[12]。3型VWD无基因热点突变区域，突变位点分散在基因的全长，主要的突变形式为无义突变，最常见的无义突变是VWF基因第28号外显子R1659X[13]。
本研究中，例1 VWF基因在第32号外显子检出c.5557C>T（p.R1853X）杂合突变（遗传自父亲），在第43号外显子检出c.7332G>A（p.W2444X）杂合突变（遗传自母亲），两个突变均为无义突变，导致氨基酸编码提前终止而影响蛋白质功能。两个突变均不属于多态性位点，人群中发生频率极低。其中，c.5557C>T（p.R1853X）为已知致病突变，在HGMD数据库中已有报道，与3型VWD相关[3]。c.7332G>A（p.W2444X）为无义突变，在HGMD专业数据库及VWD突变数据库中均未见收录，可造成氨基酸编码提前终止，Mutation Taster软件预测为致病突变。因而，例1为VWF基因2个无义突变复合杂合而导致的3型VWD患者可能性较大。
例2检出VWF基因第6号外显子c.605G>A（p.R202Q）杂合突变（遗传自父亲）第23号外显子剪切区IVS23+5G>A杂合突变（遗传自母亲）。c.605G>A（p.R202Q）为错义突变，在人群中发生频率极低，在HGMD专业数据库及VWD突变数据库中均未见收录，为新的错义突变，PolyPhen-2、SIFT及Mutation Taster软件均预测为致病突变。IVS23+5G>A是剪切区突变，该突变已有文献报道，会导致mRNA在剪切过程中发生跳跃，进而损害蛋白功能，该突变与1型和3型VWD都有关系[4]–[5]。例2 FⅧ∶C正常，VWF活性为5.7%，故其为c.605G>A（p.R202Q）和IVS23+5G>A复合杂合突变的1型VWD患者的可能性较大。
两例患儿父母均无明显临床症状，因此可推断两个家系VWD的遗传方式均为隐性遗传，从而在基因水平上明确了致病原因。
由于基因表达的不完全显性，轻症患者临床症状不典型，易被漏诊或误诊[14]。传统的Sanger测序技术是遗传学基因诊断的金标准，但是VWF基因外显子较多，应用Sanger测序逐一排查较为繁琐。本研究中，我们利用先期设计的引物库，在Ion Torrent PGM平台上进行高通量大规模平行测序，可为患者的临床诊断、遗传咨询及产前诊断提供及时准确的依据。
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