抑癌基因Hes1影响急性髓系白血病细胞增殖和凋亡的机制研究

Abstract

目的

阐明Hes1与急性髓系白血病（AML）细胞增殖和凋亡的关系。

方法

通过实时定量PCR检测AML原代细胞和HL-60、U937、KG1a细胞中Hes1和p21的表达情况；通过在AML细胞中转染逆转录病毒载体使Hes1高表达，通过MTT及流式细胞术检测高表达Hes1的AML细胞增殖和细胞周期、凋亡的改变；并通过成瘤实验检测Hes1⁺ AML细胞在NOD/SCID小鼠体内的增殖情况。

结果

Hes1和p21在AML患者原代细胞和HL-60、U937、KG1a细胞中的表达分别为0.67±0.24和0.59±0.43、0.42±0.03和0.32±0.26、0.54±0.01和0.44±0.12、0.36±0.12和0.59±0.43，均较正常对照组水平降低（P值均<0.05）；通过逆转录病毒载体诱导后HL-60、U937、KG1a细胞中Hes1的表达分别为4.9±0.2、5.2±0.4、5.8±0.5，均较未转染诱导前上调（P值均<0.05）；感染Hes1后AML细胞与感染空载体的AML细胞比较，增殖受到抑制，细胞凋亡增加。与对照组比较，3种细胞系高表达Hes1后在NOD/SCID小鼠体内的成瘤性均降低（P值均<0.05）。

结论

Hes1过表达可抑制AML细胞的增殖，诱导AML细胞凋亡，从而提示Hes1为AML的抑制基因，可能成为治疗AML的新靶点。

Notch信号通路是调节细胞分化、凋亡与增殖的关键信号通路[1]。Notch配体与受体结合后，受体的胞内结构域脱落，转移到核内与相应效应子结合，从而调节基因的转录[2]。文献报道Notch通路在造血系统肿瘤中有促癌和抑癌两种角色，这取决于疾病的类型[3]。目前已明确Notch过表达可诱导急性T淋巴细胞白血病（T-ALL）[4]，然而其在急性髓系白血病（AML）中的作用尚有争议。Li等[5]的研究结果表明，Notch受体在人早幼粒白血病细胞株HL-60中高表达。然而Lobry等[6]报道Notch信号通路在AML患者白血病细胞及AML动物模型均未激活。Kannan等[7]发现，虽然在AML细胞中Notch受体高表达，但Notch通路并未激活。Hes1是Notch通路的下游靶基因，可影响细胞的增殖、分化，并能维持造血干细胞处于静止状态[8]，而p21是Hes1的下游效应子[9]，因此我们重点研究Hes1在AML细胞中的作用及其机制。

对象和方法

1．研究对象：AML细胞系HL-60、U937和KG1a细胞由中国医学科学院血液学研究所郑国光教授赠送，培养于含10％胎牛血清（FBS）的RPMI 1640培养基中。骨髓标本来自3例AML患者（1例M₄，2例M₅）、4例正常骨髓患者（膀胱癌、乳腺癌、横纹肌肉瘤、贫血患者各1例）和1名健康人，将后两者作为正常对照组。此实验经天津市肿瘤医院伦理委员会审核批准。

2． AML原代细胞分离：在患者和健康供者充分知情同意的前提下，取骨髓5 ml（患者为治疗前）。常规肝素抗凝，PBS稀释后，用淋巴细胞分离液分离骨髓单个核细胞（BMNC），用PBS充分洗涤后重悬备用。

3．实时定量PCR：采用TRIzol（购于美国Invitrogen公司）提取AML患者细胞及对照者细胞的RNA，逆转录后，采用ABI PRISM 7500（购于美国ABI公司）行PCR。循环参数如下：95 °C 15 s；60 °C 60 s, 45个循环。Hes1引物序列上游：5′-GCAGATGACGGCTGCGCTGA-3′，下游：5′-AAGCGGGGTCACCTCGTTCATGC-3′。p21引物序列上游：5′-AATCTTGTTGATGTCCGACC-3′，下游：5′-TTGCAGAAGACCAATCTG-3′。以2^−ΔΔCT计算Hes1和p21的表达水平。

4．转染：质粒MSCV-Hes1-IRES-GFP、pCMV-VSV-G、PKAT由中国医学科学院血液学研究所程涛教授惠赠，用Lipofectamin 2000（美国Invitrogen公司）共同转入包装细胞系293T。48 h后收集病毒上清分别转染U937、HL-60和KG1a细胞，48 h后采用流式细胞术检测绿色荧光蛋白（GFP）荧光强度以判断转染效率。MSCV-IRES-GFP载体用作对照载体。

5．流式细胞术检测细胞周期和凋亡：转染后的细胞加入Hoechst33342和PY（购于美国Sigma公司）后孵育。采用流式细胞术检测G₀期的细胞比例。转染后的细胞加入Annexin V 5 µl（购于美国BD Pharmingen公司）和碘化丙锭（PI）1 µl，避光放置20 min，上流式细胞仪检测凋亡细胞比例。每组实验设3个复孔，实验重复3次。

6． MTT法检测细胞增殖的抑制率：将转染后分选的GFP⁺细胞接种于96孔板（每孔8 000×10³个细胞），每孔加入20 µl MTT（5 mg/ml），37 °C孵育4 h后，1 000 r/min（离心半径10 cm）离心10 min，弃上清后加入200 µl DMSO，振荡10 min，在酶联免疫检测仪上检测570 nm波长处吸光度（A）值。每组实验设3个复孔，实验重复3次。

增殖抑制率（％）=[1−（A_实验组−A_空白组）/（A_对照组-A_空白组）]×100%

7．体内成瘤实验：6~8周龄NOD/SCID小鼠由中国医学科学院血液学研究所动物室赠送。转染后分选的GFP⁺ U937、HL-60、KG1a细胞按每只1×10⁶个细胞皮下接种于NOD/SCID小鼠。实验组和对照组各有4~6只。注射后10、20、25、30 d测量肿瘤大小。

8．统计学处理：应用Graphpad软件进行t检验，实验数据用平均值±标准差表示。P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1． AML患者原代细胞和细胞系中Hes1的表达：Hes1及其下游效应分子p21在AML原代细胞和HL-60、U937、KG1a细胞中的表达均比正常BMNC低（表1，P值均<0.05）。

表1. Hes1及p21在急性髓系白血病（AML）原代细胞及细胞系中的表达（x±s）.

组别	Hes1	p21
正常对照组	1	1
HL-60细胞组	0.42±0.03a	0.32±0.26a
U937细胞组	0.54±0.01a	0.44±0.12a
KG1a细胞组	0.36±0.12a	0.34±0.04a
AML原代细胞组	0.67±0.24a	0.59±0.43a

注：正常对照组样本数为5; AML原代细胞组样本数为3；细胞系每组实验设3个复孔，实验重复3次。与正常对照组比较，^aP<0.05

2．转染逆转录病毒载体后Hes1的表达：转染后，通过荧光显微镜观察转染效率，通过实时定量PCR检测Hes1的表达，结果显示Hes1的表达均较转染前上调（图1，P值均<0.05）。

图1. 实时定量PCR检测转染逆转录病毒载体后细胞系中Hes1的表达（与对照组比较，*P<0.05）.

1：HL-60细胞；2：U937细胞；3：KG1a细胞

3． Hes1活化对白血病细胞体外增殖、凋亡的影响：MTT法检测结果显示，高表达Hes1的AML细胞系增殖能力均较对照组下降；流式细胞术检测结果显示：与对照组比较，Hes1⁺AML细胞大多进入G₀/G₁期；Annexin V实验结果显示：与对照组比较，Hes1⁺AML细胞的凋亡增加（表2，P值均<0.05）。

表2. Hes1活化对白血病细胞增殖的影响（%，x±s）.

组别	细胞增殖的抑制率		G0期细胞比例		细胞凋亡率
	对照	Hes1+	对照	Hes1+	对照	Hes1+
HL-60细胞组	7.8±1.1	19.6±0.2a	11.00±1.21	20.00±0.83a	5.00±0.16	13.00±1.08a
U937细胞组	8.9±0.3	23.4±1.4a	13.00±0.98	25.00±0.24a	10.00±1.65	21.00±3.12a
KG1a细胞组	4.5±0.8	26.4±0.4a	10.00±2.44	33.00±1.45a	8.00±1.03	18.00±0.73a

注：与对照组比较，^aP<0.05；每组实验设3个复孔，实验重复3次

4． Hes1活化对白血病细胞体内增殖的影响：成瘤实验结果显示，与对照组比较，3种细胞系高表达Hes1后在NOD/SCID小鼠体内的成瘤性均降低（图2，P值均<0.05）。

图2. 体内成瘤检测Hes1活化对白血病细胞体内增殖的影响（与对照组比较，*P<0.05，每组鼠数为4只）.

A：HL-60细胞；B：U937细胞；C：KG1a细胞

讨论

Notch信号通路在造血细胞的分化发育中发挥着重要的作用[10]。文献报道Notch信号通路的异常激活能导致某些造血系统恶性肿瘤[11]。例如，已证实染色体易位t(7; 9）（q34；q34.3）是T-ALL的病因[12]。不同于ALL，Notch通路在AML中的作用尚有争议。Mirandola等[13]报道，Notch受体在AML患者原代细胞表达升高，但其靶基因Hes1的表达水平较低，表明AML细胞中Notch信号通路未激活。同样，有研究者报道，AML细胞株和原代AML细胞高表达Notch受体，阻断Notch通路后可抑制AML细胞株的增殖[14]–[15]。Li等[5]发现HL-60细胞高表达Notch配体和受体，阻断Notch通路后抑制HL-60细胞的增殖并诱导HL-60细胞凋亡。Xu等[2]发现，与正常对照组比较，Notch1及其配体Jagged1和Delta1在AML细胞中上调。

然而，也有与此相反的文献报道。Chadwick等[3]报道Notch通路的活化可抑制AML细胞的生长并诱导凋亡。同样地，Yin等[16]证明活化的Notch通路可抑制K562细胞的增殖和集落形成。Kannan等[7]报道Notch受体的激活导致AML生长受抑和caspase依赖的细胞凋亡，这与Bcl-2、p53和p21的表达相关。Lobry等[6]发现，Notch信号通路在AML原代细胞表达很低，该通路的活化会促使细胞凋亡。

Hes1是Notch通路下游的效应子[17]。文献报道其在造血细胞发育及某些恶性血液病中起重要作用[18]。Hes1基因参与细胞周期，能维持某些成体干细胞处于未分化的静止状态[19]–[22]。鉴于Notch受体活化在AML中的不同观点，我们将研究重点放在其下游分子Hes1上。首先我们检测了Hes1在HL-60、U937、KG1a和AML患者原代细胞中的表达情况。结果发现，Hes1及其下游效应子p21在AML细胞株和患者样本中表达很弱。而通过转染增强Hes1表达后，AML细胞的增殖受到抑制。细胞周期分析结果显示，更多的Hes1⁺AML细胞进入G₀期并诱导细胞凋亡。而Hes1的高表达也激活了下游效应子p21的表达。因此我们的结果表明Hes1是通过p21通路影响AML细胞。总之，我们的结果表明Hes1通过抑制AML细胞增殖和诱导AML细胞的凋亡来发挥抗肿瘤的活性，从而证实Hes1是潜在的治疗AML的新靶点。

Funding Statement

基金项目：国家自然科学基金（31301161、81270603）；天津市应用基础与前沿技术研究计划（13JCYBJC22800）