抗CD19 CAR-T细胞治疗E2A-PBX1阳性复发难治急性B淋巴细胞白血病三例临床分析

成人急性淋巴细胞白血病（ALL）是最常见的成人急性白血病之一。伴t（1;19）（q23;p13）细胞遗传学异常的ALL占儿童ALL的3%~5%、成人ALL的3%左右[1]–[2]，易位形成E2A-PBX1融合基因。该亚型成人患者化疗反应差，疗效不佳。异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）能改善生存[3]，但对于缺乏合适供者或allo-HSCT后复发的该类患者，需要探索新的治疗方案。抗CD19嵌合抗原受体T细胞（CD19 CAR-T细胞）因为具有不依赖于主要组织相容性复合物（MHC）的特异性杀伤肿瘤细胞的特点受到了广泛关注，应用于临床后取得了一定的疗效。我们总结我院2016年采用抗CD19 CAR-T细胞治疗3例复发难治E2A-PBX1融合基因阳性成人B-ALL患者，报告如下。

病例与方法

1．病例：3例患者中男1例，女2例，均经临床病史、细胞形态学、流式细胞学、细胞遗传学及分子生物学等检查确诊为E2A-PBX1阳性B-ALL。诊断标准参照文献[4]。本研究经我院伦理委员会批准[（2015）伦审批第070号]，同时经患者本人或监护人知情同意。

2．实验室方法：①染色体核型分析采用骨髓细胞直接法或24 h培养法，R显带技术进行核型分析，每例患者至少分析10个中期细胞。②免疫分型及微小残留病（MRD）监测采用FACS Calibur型流式细胞仪（美国Becton Dickinson公司产品）间接免疫荧光法和一组单抗检测肿瘤细胞的表面抗原。MRD检测敏感度为10⁻⁴。③采用多重巢式PCR方法检测急性白血病相关的43种融合基因，并采用实时荧光定量PCR（RQ-PCR）方法确定E2A-PBX1融合基因拷贝数，RQ-PCR检测敏感度为10⁻⁴。

3．治疗方案：例1、例2诱导治疗采用CIVP（环磷酰胺+去甲氧柔红霉素+长春地辛+地塞米松）方案。例3采用DVP（柔红霉素+长春地辛+地塞米松）方案。例1诱导化疗后获得完全缓解（CR），随后采用hyper-CVAD（B）（大剂量甲氨蝶呤+阿糖胞苷）方案巩固化疗；例2骨髓检查提示未缓解，考虑难治性白血病，遂予以hyper-CVAD（A）（环磷酰胺+长春地辛+多柔比星+地塞米松）方案再诱导治疗；例3诱导化疗后亦获得CR，后采用DVLP（柔红霉素+长春地辛+培门冬酶+地塞米松）、培门冬酶+大剂量甲氨蝶呤（HD-MTX）等方案巩固化疗。例1、例3经上述巩固化疗后进入移植程序，但移植后本病均复发，复发后采用CAR-T细胞治疗。例2则先采用CAR-T细胞治疗，随后进入移植程序。CAR-T细胞来源为患者本人或移植供者外周血T淋巴细胞，通过慢病毒载体将CAR结构片段（anti-CD19 scFv/4-1BB/CD3ζ）转染进入T细胞，并进行体外扩增（上海优卡迪生物医药科技有限公司制备）。患者经FC（氟达拉滨+环磷酰胺）方案预处理后，分次输注CAR-T细胞，中位输注量为5.0（3.5~10.0）×10⁶/kg。

4．随访：随访截止日期为2017年6月1日，随访方式为电话随访或病案查询。

结果

3例患者临床特征见表1。患者骨髓形态学检查显示原始细胞比例均超过0.750，白血病免疫分型检查均见CD19阳性表达。例1 CAR-T细胞治疗后CD19阳性细胞比例明显下降；例2 CAR-T细胞治疗前后未行骨髓CD19阳性细胞比例检查；例3 CAR-T细胞治疗前检查CD19阳性细胞比例，CAR-T细胞治疗后未查。例1、例2 CAR-T细胞治疗后行骨髓流式细胞术检查，提示MRD均得到清除。3例患者CAR-T细胞治疗前E2A-PBX1融合基因结果均为阳性，治疗后例1、例2融合基因转为阴性，例3 CAR-T细胞治疗后本病进展，融合基因水平明显升高。CAR-T细胞治疗前后骨髓相关检测结果及CAR-T细胞不良反应与转归情况见表2。3例患者的CAR-T细胞治疗详细经过如下。

表1. 3例E2A-PBX1阳性急性B淋巴细胞白血病患者的临床及实验室检查资料.

例号	性别	年龄（岁）	初诊WBC(×109/L)	HGB（g/L)	PLT（×109/L)	骨髓原始细胞	免疫分型	核型	达CR疗程数	难治或复发	移植前复发	移植后复发	CAR-T细胞
													应用时间	来源	数量(×106/kg)
1	男	15	12.53	115	187	0.840	HLA-DR、CD10、CD19阳性	46,der(X)t(X;1), der(7),19p+[10]	1	复发	是	是	移植后	本人	10.0
2	女	27	37.99	78	11	0.795	CD34、CD10、CD19阳性	46,XX,der(19)?t(1;19)[4]/46，XX[6]	2	难治			移植前	本人	5.0
3	女	30	8.20	92	36	0.980	CD9、CD19阳性	46,XY	1	复发	否	是	移植后	供者	3.5

注：CR：完全缓解；CAR-T细胞：嵌合抗原受体T细胞

表2. 3例E2A-PBX1阳性急性B淋巴细胞白血病患者抗CD19 CAR-T细胞治疗的相关资料及转归情况.

例号	CAR-T治疗前骨髓检查				CAR-T治疗后骨髓检查				不良反应和转归
	形态学	MRD	CD19阳性细胞	E2A-PBX1水平	形态学	MRD	CD19阳性细胞	E2A-PBX1	CRS等级	神经毒性	转归	生存期（月）
1	原幼细胞0.780	55.1%	98.00%	671.84%	原幼细胞0.020	阴性	0.16%	阴性	Ⅰ	谵妄	死亡	12
2	缓解中	1.8×10−4	−	2.36%	缓解中	阴性	−	阴性	Ⅰ	无	生存	8
3	缓解中	−	31.50%	2.26%	原幼细胞0.280	−	−	124.34%	Ⅰ	无	生存	7

注：CAR-T细胞：嵌合抗原受体T细胞；MRD：微小残留病；CRS：细胞因子释放综合征；−：未检查

例1虽经诱导化疗达CR，但同时期E2A-PBX1融合基因水平为148.92%。行BU/CY（白消安+环磷酰胺）方案预处理第1天复查骨髓提示本病复发，完成预处理，造血干细胞回输前1天复查骨髓示骨髓抑制状态，E2A-PBX1融合基因仍能检测到。回输后连续多次复查骨髓形态学及MRD均提示缓解中，但未常规复查E2A-PBX1融合基因。移植后5个月骨髓象示原幼细胞占0.780，MRD 55.1%，E2A-PBX1融合基因671.84%，提示本病复发。遂收住入院予培门冬酶+VP（长春地辛+地塞米松）方案再诱导、干扰素联合供者干细胞输注诱发移植物抗白血病（GVL）效应。同时采集患者本人的外周血T细胞制备CAR-T细胞。CAR-T细胞制备完毕后，行FC（氟达拉滨+环磷酰胺）方案预处理及CAR-T细胞回输。回输CAR-T细胞总量为10×10⁶/kg。回输后第9天复查骨髓提示未检测到E2A-PBX1融合基因。回输后第2天患者出现中等度热，最高体温38.3 °C，对症处理后体温恢复正常。回输后第5~15天，患者持续发热，每日最高体温38.0 °C~39.3 °C，期间生命体征平稳，胸部CT未见感染性病变，降钙素原、GM/G试验未见异常，多次血、尿、粪培养均为阴性。予广覆盖抗感染处理，仍持续发热。结合细胞因子、外周血CAR-T细胞数、C反应蛋白（CRP）等指标明显升高，尤其是IL-6及IFN-γ显著升高，评估为细胞因子释放综合征（CRS）Ⅰ级。予非甾体类消炎药对症退热处理，未使用激素及托珠单抗。回输后第6天有谵妄表现，加用盐酸舍曲林调节情绪，于第8天恢复正常。第16天患者因个人原因自动出院，于2017年1月死于多脏器功能衰竭。

例2经hyper-CVAD（A）方案再诱导后获骨髓形态学缓解，E2A-PBX1融合基因定量为2.36%。为进一步清除残留白血病细胞，行自体外周血T细胞来源的CAR-T细胞治疗，回输CAR-T细胞总量为5×10⁶/kg。输注后第1、6、7、8天出现发热，体温最高39.1 °C，同时伴随外周血CAR-T细胞数、细胞因子升高，但升高幅度明显低于例1，CRP未上升，生命体征平稳，评估为CRS Ⅰ级。予非甾体类消炎药对症处理后体温恢复正常。患者回输后无神经系统毒性反应。于第12天顺利出院。后桥接父供女造血干细胞移植。目前移植后4个月，随访截止时处于疾病缓解状态。

例3诱导化疗后骨髓形态学持续缓解，但移植前E2A-PBX1融合基因未转阴，为3.73%。经同胞HLA5/10相合造血干细胞移植后连续4次复查E2A-PBX1融合基因均为阴性，但移植后6个月复查融合基因转为阳性，为0.16%，后监测该融合基因逐渐升高（分别为0.26%、1.31%、2.26%）。期间骨髓形态学检查呈持续缓解状态，考虑分子水平复发，遂行移植供者外周血T细胞来源的CAR-T细胞治疗。回输CAR-T细胞总量为3.5×10⁶/kg。输注后第1天起出现持续发热，体温最高39.6 °C，伴低氧血症，病原学及影像学检查证实重症肺炎。予联合抗感染治疗后未见好转。输注后外周血CAR-T细胞数出现一过性升高，细胞因子、CRP升高，评估为CRS Ⅰ级。CAR-T细胞治疗后无神经系统毒性反应。第7天复查骨髓示形态学复发，原幼细胞占0.280。后患者回当地医院继续抗感染治疗及化疗。随访截止时仍生存。

讨论

既往临床研究表明，复发难治ALL预后极差，中位生存时间一般不超过6个月[5]。其中，UKALL12/ECOG 2993研究共纳入609例包含各亚型的复发ALL患者，超过90%的患者在后续随访中死于复发，5年生存率不超过10%[6]。医学界对于复发难治白血病治疗方案的探索从未停歇，抗CD19 CAR-T细胞疗法便是近年来研究的热点之一。

CD19广泛表达于正常B淋巴细胞及大多数B系恶性肿瘤细胞，包括B-ALL、慢性淋巴细胞白血病以及B细胞非霍奇金淋巴瘤。在CD19阳性B系恶性肿瘤的治疗中，抗CD19 CAR-T细胞疗法显示出显著的抗肿瘤活性。在部分研究中，CR率可达90%，且伴随较高的MRD清除率[7]–[9]。本组例1、例2经CAR-T细胞治疗后，无论是流式细胞术检测免疫残留或PCR法检测白血病特异性E2A-PBX1融合基因，均达到了MRD清除效果。

目前众多临床研究证实抗CD19 CAR-T细胞疗法治疗B-ALL疗效确切，但仍面临较多问题，主要包括以下几个方面。

1．治疗相关不良反应：几乎所有的临床试验均报道了治疗相关不良反应，尤其是CRS和神经毒性。CRS症状表现多样，最常见的表现为发热，可伴肌肉酸痛、全身不适等流感样症状，严重时可有低氧血症、低血压等渗漏综合征表现。CRS的实验室检查主要表现为细胞因子的升高，尤其是IL-6。另外，CRS时常伴随CRP的升高。有研究表明CRP能作为预测CRS严重程度的可靠指标[8]。本组例1患者发生CRS时CRP即明显升高，CRS也较严重，而例2、例3 CRP升高幅度不及例1，CRS也较轻微。另有研究表明，CRS与较高的CAR-T细胞输注数量及输注前较高的肿瘤负荷相关。对于输注前肿瘤负荷较高的患者，减低输注总剂量能减轻CRS[9]–[10]。CAR-T细胞治疗后常见的神经毒性表现包括谵妄、失语、癫痫、幻视等。本组3例患者经CAR-T细胞治疗后均出现39 °C以上发热，CRS评估均为Ⅰ级，3例患者中仅例1出现短暂的神经毒性表现。

2．复发：CAR-T细胞治疗后骨髓形态学缓解率及MRD清除率均较高，但仍有病情进展或复发的可能[10]–[11]。经抗CD19 CAR-T细胞治疗后复发的患者，常表现为肿瘤细胞膜表面CD19的缺失，从而引发免疫逃逸，提示复发可能与靶向治疗筛选出免疫逃逸的白血病细胞株有关。进一步研究显示在T细胞靶向治疗的压力下，预先存在的缺乏膜表面CD19抗原表位的B-ALL细胞株被筛选出来并扩增导致白血病的复发[11]。本组3例患者中，例3经CAR-T细胞治疗后本病进展，例1、例2随访截止时未见本病进展或复发。

3．成本高、难于推广：既往的临床研究中，CAR-T细胞来源多是患者本人或HLA匹配的供者。CAR-T细胞治疗相关工作量大，成本高，不利于该疗法的规模化推广。近期有研究报道，采用慢病毒转染非HLA匹配的无关供者来源的T淋巴细胞制备的抗CD19 CAR-T细胞，回输给2例B-ALL患儿，取得了分子水平的缓解，且疗效维持时间长，2例患儿均顺利过渡至造血干细胞移植。其主要特色是采用转录活化样效应核酸酶介导的T细胞受体α链和CD52基因位点的基因编辑技术，提示应用基因编辑技术制备抗CD19 CAR-T细胞的安全性及有效性[12]。若该技术的安全性和有效性能获得大规模临床研究的证实，抗CD19 CAR-T细胞疗法的规模化应用前景可期。

Funding Statement

基金项目：江苏省科教兴卫工程-临床医学中心资助（ZX201102）；国家自然科学基金（81370626）