苯乙肼对Molt-4细胞增殖、凋亡及组蛋白甲基化、乙酰化的影响

Abstract

Objective

To investigate the effect of monoamine oxidase inhibitor phenelzine on proliferation, apoptosis and histone modulation in acute lymphoblastic leukemia cell line Molt-4 cells.

Methods

The effect of Phenelzine on cell proliferation was detected by MTT. Apoptotic rate was measured by flow cytometry. The variation of apoptosis associated proteins Caspase-3, Bcl-2 and Bax, cyclin-dependent kinase inhibitor p21, tumor suppressor protein p15, and the expression level of histone methylation of H3K4, H3K9 and histone acetylation of H3, DNMT1 were detected by Western Blot.

Results

①Molt-4 cell proliferation rates were (87.68±3.54)%, (67.84±3.24)%, (51.48±3.37)%, (28.72±2.56)% respectively after exposured to phenelzine at 5, 10, 15, 20 µmol/L for 24 h,P<0.05. ②After 10 µmol/L of phenelzine exposure for 24, 48, 72 h, cell proliferation rates were (67.84±3.24)%, (50.24±2.01)%, (40.31±2.25)%,P<0.05. ③The apoptotic rates were (13.64±2.58)%, (31.24±3.42)%, (56.37±4.26)% after phenelzine treatment at 5, 10, 20 µmol/L for 24 h, which was concentration dependent. ④Phenelzine could upregulate the expression of Bax, caspase-3, p21, and downregulate Bcl-2 expression. Phenelzine upregulated the methylation level of histone H3K4me1, H3K4me2 and histone acetylated H3, while it didn't change the level of histone H3K4me3, H3K9me1, H3K9me2. ⑤Phenelzine inhibited DNMT1 expression and promoted p15 expression.

Conclusion

Phenelzine increased the methylation of histone H3K4me1, H3K4me2, acetylation of histone H3 and p21, and decreased the expression of DNMT1 and p15, and ultimately inhibited the proliferation and apoptosis of Molt-4 cells.

组蛋白赖氨酸甲基化是重要的转录调控机制，由组蛋白甲基转移酶和去甲基转移酶共同介导完成。Shi等[1]发现组蛋白赖氨酸特异性去甲基化酶1(LSD1)是黄素腺嘌呤二核苷酸(flavin adeniine dinucleotide，FAD)依赖性胺氧化酶，能使组蛋白H3第四位赖氨酸(H3K4)发生去甲基化。LSD1在体外可以特异去除组蛋白H3K4的单甲基和二甲基修饰，在体内与雄激素／雌激素受体结合后则可去除H3K9的单甲基和二甲基修饰，但对三甲基化无能为力[2]。研究表明，LSDl能够使DNA甲基转移酶1(DNMT1)发生脱甲基化，导致DNA甲基化失衡[3]。目前证实组蛋白甲基化与去甲基化失平衡与肿瘤发生发展密切相关，现已发现多种肿瘤细胞中均高表达LSD1[4]–[5]，因此，LSD1作为一种去甲基化酶，有可能成为一个新的抗肿瘤治疗靶标。

单胺氧化酶(MAO)和LSD1对氧化分解底物N-C键有着共同机制，许多MAO抑制剂(MAOI)被证实为LSD1抑制剂，其中苯乙肼对LSD1有较明显的抑制作用[6]。目前尚未见MAOI对急性白血病细胞作用的报道。本实验以急性T淋巴细胞白血病细胞株Molt-4为模型，研究苯乙肼对急性T淋巴细胞白血病细胞表观遗传学调控的影响，初步探讨其机制，为临床靶向治疗提供实验依据。

材料与方法

1．试剂：苯乙肼购自美国Gene公司，以DMSO溶解配制10 mmol/L，经0.22 µm微孔滤膜正压过滤后−20 °C保存；胎牛血清购自杭州四季青生物制品公司；Annexin Ⅴ/PI双染试剂盒购自美国BD公司；MTT (5 mg/ml)及DMSO均购自美国Sigma公司；抗组蛋白H3K4me1、H3K4me2、H3K4me3、H3K9me1、H3K9me2、Act-H3抗体购自美国Upstate公司；caspase-3、Bcl-2、Bax、p21、p15、DNMT1、β-actin鼠抗人单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠二抗及Western blot化学发光工作液均购自美国Santa Cruz公司。

2．细胞培养：人类急性T淋巴细胞白血病细胞株Molt-4细胞购自中科院上海细胞库，用含15％胎牛血清、2 mmol/L左旋谷氨酰胺的RPMI1640培养液置37 °C、饱和湿度、5%CO₂培养箱培养，细胞呈悬浮生长，每2~3 d传代1次。实验前经锥虫蓝拒染法检测细胞活力。

3．MTT法检测细胞增殖率：取对数生长期Molt-4细胞(1.0×10⁵/ml)接种于96孔细胞培养板，每孔100 µl。实验组加入苯乙肼(终浓度5、10、15、20 µmol/L)，每组设6个平行孔，以未加苯乙肼(0 µmol/L)为对照组。72 h后，加5 mg/ml MTT 10 µl，继续培养4 h，离心(1 000×g)后吸去上清，每孔加100 µl DMSO，充分振荡混匀，在酶标仪上测定492 nm和630 nm处吸光度(A)值。实验重复3次。空白对照组为无细胞RPMI 1640培养液。

$$细胞增殖率(\%)=(A_{实验}-A_{空白对照})/(A_{对照}-A_{空白对照}）\times 100\%$$

4．流式细胞术分析细胞凋亡：取Molt-4细胞用含15％胎牛血清的RPMI 1640培养基接种于75 ml培养瓶，每瓶接种2×10⁶细胞，细胞密度为2×10⁵/ml，分别加入苯乙肼(终浓度为0、5、10、20 µmol/L)，作用24 h后室温离心(1 000×g)5 min收集处理细胞。按照美国BD公司AnnexinⅤ和PI双染试剂盒说明书处理后，立即行流式细胞术检测。

5．Western blot法检测细胞凋亡、组蛋白甲基化及乙酰化蛋白：采用Western blot法检测凋亡相关蛋白caspase-3、Bcl-2、Bax，细胞周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白p21，抑癌蛋白p15，组蛋白H3K4、H3K9甲基化及组蛋白H3乙酰化、DNMT1水平的变化。收集经不同浓度苯乙肼处理后的细胞，提取总蛋白。采用Bradford法进行蛋白定量，聚丙烯酰胺凝胶电泳，电转移法转膜，室温下摇床封闭1 h，加入用TBS稀释(根据目的蛋白调整稀释倍数)的一抗4 °C过夜，TBS洗涤液洗膜后分别加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶2 000~1∶5 000)，室温下摇床1 h，再洗膜5次，显色及曝光，X射线胶片扫描后，以β-actin为内参，用AlphaDigiDoc图像分析软件进行分析比较，以目的蛋白与β-actin灰度值比值作为相对表达量。

6．统计学处理：采用SPSS17.0软件进行数据分析。常规进行方差齐性检验，正态性检验。计量资料实验数据以x±s表示。单变量两组资料之间的比较采用t检验；多组资料之间的比较采用单因素方差分析；方差不齐采用非参数检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1．苯乙肼对Molt-4细胞增殖的抑制作用：5、10、15、20 µmol/L苯乙肼作用24、48、72 h, Molt-4细胞增殖率随苯乙肼浓度的增加而逐渐下降(P< 0.05)。同一浓度苯乙肼作用24、48、72 h的Molt-4细胞增殖率逐渐下降(P<0.05)。详见表1。

表1. 不同浓度苯乙肼处理不同时间Molt-4细胞的增殖率(%，x±s).

组别	作用时间
	24 h	48 h	72 h
5 µmol/L组	87.68±3.54	81.43±3.56	77.14±2.48
10 µmol/L组	67.84±3.24	50.24±2.01	40.31±2.25
15 µmol/L组	51.48±3.37	38.58±2.83	29.12±3.44
20 µmol/L组	28.72±2.56	21.43±2.13	6.43±1.63

注：同一浓度组不同作用时间、不同浓度组同一作用时间结果比较，P值均<0.05。实验重复3次

2．流式细胞术检测苯乙肼诱导Molt-4细胞凋亡：Molt-4细胞经0(对照组)、5、10、20 µmol/L苯乙肼作用24 h后的凋亡率分别为(4.53±1.33)%、(13.64±2.58)%、(31.24±3.42)%、(56.37±4.26)%，凋亡率随苯乙肼浓度的增加而逐渐上升(P<0.05) (图1)。

图1. 流式细胞术检测Molt-4细胞经不同浓度苯乙肼作用24 h的凋亡率.

3．Western blot法检测苯乙肼对Molt-4细胞凋亡相关蛋白表达的影响：Molt-4细胞经5、10、20 µmol/L苯乙肼处理24 h，凋亡抑制蛋白Bcl-2的相对表达量低于对照组(0 µmol/L苯乙肼)，Bax、caspase-3、p21的相对表达量高于对照组(P<0.05)(图2、表2)。

图2. Western blot法检测Molt-4细胞经不同浓度苯乙肼处理24 h的细胞凋亡蛋白的表达.

1：对照组；2~4分别为5、10、20 µmol/L苯乙肼处理组

表2. Western blot法检测Molt-4细胞经不同浓度苯乙肼处理24 h的凋亡蛋白相对表达量(x±s).

组别	caspase-3	Bcl-2	Bax	p21
对照组	0.010±0.011	0.778±0.032	0.091±0.009	0.075±0.006
苯乙肼处理组
5 µmol/L	0.325±0.033	0.536±0.035	0.298±0.027	0.110±0.012
10 µmol/L	0.557±0.032	0.412±0.031	0.524±0.025	0.314±0.021
20 µmol/L	0.789±0.045	0.306±0.030	0.671±0.031	0.704±0.029

注：各浓度苯乙肼处理组与对照组(0 µmol/L)相比，P值均<0.05。实验重复3次

4．Western blot法检测苯乙肼对组蛋白H3K4甲基化、H3K9甲基化和H3乙酰化的影响：10、20 µmol/L苯乙肼可上调组蛋白H3K4单甲基化、二甲基化水平并呈量效关系(P<0.05)；H3K4三甲基化、H3K9单甲基化及H3K9二甲基化与对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。10、20 µmol/L苯乙肼处理组的组蛋白H3乙酰化水平上调(P<0.05)(图3、表3)。

图3. Western blot法检测不同浓度苯乙肼处理24 h Molt-4细胞的组蛋白修饰的变化.

1：对照组；2~4分别为5、10、20 µmol/L苯乙肼处理组；H3K4me1：组蛋白H3K4单甲基化；H3K4me2：组蛋白H3K4二甲基化；H3K4me3：组蛋白H3K4三甲基化；H3K9me1：组蛋白H3K9单甲基化；H3K9me2：组蛋白H3K9二甲基化；Act-H3：组蛋白H3乙酰化

表3. Western blot方法检测不同浓度苯乙肼处理Molt-4细胞24 h的细胞组蛋白甲基化、乙酰化水平(x±s).

组别	H3K4me1	H3K4me2	H3K4me3	H3K9me1	H3K9me2	Act-H3
对照组	0.807±0.051	0.547±0.039	1.009±0.052	1.045±0.056	1.141±0.044	0.839±0.049
苯乙肼处理组
5 µmol/L	1.005±0.043a	0.584±0.037	1.020±0.053	1.034±0.059	1.132±0.052	0.945±0.054
10 µmol/L	1.254±0.037a	0.812±0.042a	0.952±0.055	1.041±0.052	1.123±0.049	1.329±0.053a
20 µmol/L	1.583±0.056a	0.974±0.050a	0.941±0.050	1.038±0.049	1.140±0.051	1.839±0.055a

注：H3K4me1：组蛋白H3K4单甲基化；H3K4me2：组蛋白H3K4二甲基化；H3K4me3：组蛋白H3K4三甲基化；H3K9me1：组蛋白H3K9单甲基化；H3K9me2：组蛋白H3K9二甲基化；Act-H3：组蛋白H3乙酰化；与对照组(0 µmol/L苯乙肼)比较，^aP <0.05。实验重复3次

5．Western blot方法检测苯乙肼对Molt-4细胞DNMT1、p15蛋白表达的影响：终浓度5、10、20 µmol/L的苯乙肼处理Molt-4细胞24 h后Molt-4细胞DNMT1表达呈浓度依赖性下降(P<0.05)，p15蛋白相对表达量均高于对照组(P<0.05)(图4、表4)。

图4. Western blot法检测Molt-4细胞经不同浓度苯乙肼处理24 h后p15、DNA甲基转移酶1(DNMT1)蛋白表达.

1：对照组（0 µmol/L 苯乙肼）；2~4分别为5、10、20 µmol/L苯乙肼处理组

表4. Western blot方法检测不同浓度苯乙肼处理24 h后Molt-4细胞p15、DNMT1蛋白相对表达水平(x±s).

组别	p15	DNMT1
对照组	0.010±0.011	0.758±0.032
苯乙肼处理组
5 µmol/L	0.214±0.026	0.366±0.025
10 µmol/L	0.379±0.025	0.197±0.021
20 µmol/L	0.949±0.034	0.113±0.009

注：DNMT1：DNA甲基转移酶1。各浓度苯乙肼处理组与对照组(0 µmol/L苯乙肼组)比较，P值均<0.05。实验重复3次

讨论

Lim等[7]应用单胺氧化酶抑制剂反苯环丙胺(tranylcypromine)抑制雌激素受体阴性的乳腺癌细胞LSD1活性，从而抑制细胞增殖。Huang等[8]发现在人结肠癌细胞中SFRP1、SFRP4、SFRP5和GATA5等基因异常沉默，应用多胺类似物抑制剂bisg uanidine 1c抑制其LSD1活性后可导致以上异常沉默的基因重新表达，最终诱发细胞凋亡。本研究结果显示，苯乙肼能抑制Molt-4细胞的增殖，且呈时间、浓度依赖性。细胞增殖过度与细胞周期紊乱有关。p21^CIP1/WAF1是最先发现的细胞周期蛋白依赖性激酶抑制基因，当正常细胞DNA受损伤时，p21基因可由p53或其他因子如Sp1/Sp3、Smads、BRCA1、Ap2、E2F-1/E2F-3等激活，随后抑制DNA复制，使细胞周期停滞，并促进DNA修复，从而避免由于DNA损伤的积累而引发肿瘤。本研究结果表明苯乙肼可上调p21蛋白表达，提示苯乙肼可通过上调细胞周期相关蛋白p21来抑制细胞的增殖。同时研究表明苯乙肼可诱导细胞凋亡(呈浓度依赖性)，并且caspase-3和Bax表达量随着苯乙肼浓度的增加而逐渐增加，Bcl-2表达量随着苯乙肼浓度的增加而逐渐减少，这提示苯乙肼可能通过线粒体途径诱导细胞的凋亡。

LSD1是H3K4特异性去甲基化酶，只能去除单甲基化及二甲基化的甲基基团。本研究结果显示Molt-4细胞经苯乙肼处理24 h即可出现H3K4单甲基化、二甲基化明显升高，但H3K4三甲基化及H3K9甲基化无明显变化。在大多数情况下H3K4二甲基化和H3K4三甲基化与基因的激活有关，但是H3K4三甲基化在细胞受到某种信号刺激下还可通过ING2的PHD结构域被识别，并招募mSin3a-HDAC1复合体，介导基因的抑制[9]。H3K4二甲基化的分布范围较广，位于活性转录基因的主要部分，而三甲基化则局限分布在活性转录基因的5′端[10]。应用苯乙肼抑制LSD1后，H3K4单甲基化和二甲基化水平上调，从而促进转录，使沉默的基因重新表达，并抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡。这与本课题组前期研究[11]发现敲除JARID1B后可上调组蛋白H3K4甲基化并抑制急性白血病细胞增殖、诱导细胞凋亡的结果相同。LSD1还可通过和CoREST及HDAC1/2形成一个多蛋白复合体发挥抑制基因表达的作用[12]。本研究结果显示苯乙肼抑制LSD1后H3乙酰化表达量亦增加，其机制也许是H3K4甲基化后通过其结合的效应蛋白直接募集组蛋白乙酰转移酶，亦或是通过H3K4的甲基化影响到该位点其他修饰，再进一步促进组蛋白乙酰转移酶活性。此外H3K4去甲基后，未甲基化的K4位点可结合DNMT的正调控因子DNMT3L，促进DNMT的表达，引起DNA重新甲基化，导致基因转录抑制[13]。p15基因是一个重要的抑癌基因，启动子区域的CpG岛甲基化能使基因沉默，而去甲基化可使基因活化。本实验结果显示，H3K4甲基化水平增加后可能通过效应分子下调DNMT1表达使p15基因去甲基化，p15蛋白表达增加。这与本课题组前期研究[14]结果一致。

本研究结果显示，苯乙肼可上调与常染色体有关的组蛋白H3K4单甲基化及二甲基化和组蛋白H3乙酰化水平，但对H3K4三甲基化及与异染色质有关的H3K9甲基化无影响。苯乙肼通过上调p21蛋白表达及下调DNMT1表达诱导p15基因去甲基化，使p15蛋白重新表达，抑制Molt-4细胞的增殖，同时裂解Bcl-2并上调Bax表达，启动效应蛋白caspases-3，诱导细胞凋亡。

Funding Statement

基金项目：福建省自然科学基金（2012J01420）；福建省医学创新课题（2012-CX-32）；福建省引进重大项目计划基金（2012I2004）；漳州市科学研究发展计划基金（20100080）；福建医科大学重点科研项目（FZS13004Z）

Fund project: The Natural Science Foundation of Fujian Province（2012J01420）; The Medical Innovation Research of Fujian Province（2012-CX-32）; The Introductory Major Project Plan Fund of Fujian Province（2012I2004）; The Scientific Research and Development Plan Fund of Zhangzhou（20100080）; The Key Research Projects of Fujian Medical University（FZS13004Z）