两年一度的国际慢性淋巴细胞白血病工作组(iwCLL)会议于2015年9月6日至9日在澳大利亚悉尼召开。本次会议专家学者们就慢性淋巴细胞白血病(CLL)的发病机制、微环境、免疫系统改变、诊断、预后及治疗等最新进展进行了交流。我们就会议内容介绍如下。
一、发病机制
1．细胞遗传学和信号通路异常：CLL是一种高度异质性疾病，存在11q−者预后差，而存在13q−者预后好。澳大利亚Flinders University的Thurgood等对11q−、13q−和正常核型的CLL患者骨髓单个核细胞(BMMNC)进行蛋白质谱分析，发现11q−相比13q−，线粒体功能障碍和氧化磷酸化反应相关蛋白表达增加，其中巨噬细胞抑制因子(MIF)和带3阴离子转运蛋白表达明显增加。MIF与细胞内p53功能抑制、持续ERK信号通路活化相关，而带3阴离子转运蛋白参与氧调节代谢转变过程。研究者进一步通过信号网络分析(IPA)将改变最大的25种蛋白进行分类后发现，13q−CLL患者BMMNC中增强的通路与糖原降解、糖酵解、DNA双链断裂修复、整合素连接激酶信号传导和端粒酶介导的端粒延长相关。11q−CLL患者BMMNC中增强的脂质代谢和白三烯合成通路、mTOR和14-3-3信号通路以及核质转运(RAN)信号通路相关，提示11q−CLL患者的不良预后可能与细胞脂类代谢增强和凋亡受阻有关。
单个细胞基因突变在细胞群体里发生频率的累积常作为疾病发生、发展的驱动因素。瑞典Uppsala University的Young等报道了EGR2突变(外显子2热点突变区域)，1 430例CLL患者中有41例(2.9%)发生EGR2错义突变，2例为框内缺失突变；与CLL患者组比较，不良预后组(18/325, 5.5%)和氟达拉滨耐药组(4/41, 9.8%)患者的EGR2突变率明显增加。39例EGR2突变者中有32例(82.0%)同时无IGHV突变，其中10例伴11q−，6例伴TP53异常，伴NOTCH1突变和SF3B1突变各3例。SF3B1突变患者总生存(OS)时间明显短于无突变者。EGR2突变后其下游靶基因表达受影响，可能导致B细胞受体(BCR)信号通路的异常调节，因此BCR抑制剂对EGR2突变的患者疗效值得期待。
英国University of Southampton的Strefford等在UK LRF CLL4Ⅲ期临床试验中对384例CLL患者的端粒酶长度进行研究，发现端粒酶长度缩短作为独立预后因素提示无进展生存(PFS)和OS时间缩短及死亡风险增加(HR=2.1)。端粒酶长度与IGHV突变状态、ZAP70和CD38表达、TP53异常、11q−、复杂核型、ATM和SF3B1突变等预后不良因素均显著相关。
激活诱导的胞苷脱氨酶(AID)是免疫球蛋白基因发生体细胞高频突变(SHM)和抗体种类转换重组(CSR)过程的不可或缺的起始蛋白酶。乌拉圭Institut Pasteur de Montevideo的Pablo等构建了高表达AID的actin-AID/Eu-TCL1双转基因小鼠模型，相比Eu-TCL1小鼠，此双转基因小鼠外周血白细胞总数和IgM+CD5+CLL细胞百分数均增加，同时肝、脾为大量淋巴细胞所浸润，OS时间明显缩短(P=0.0003)。认为过表达AID通过介导免疫球蛋白基因外的未知非靶标基因突变增强了CLL细胞增殖能力。
2．微环境异常：CLL微环境中间充质干细胞、巨噬细胞以及表达CD40L的T细胞与肿瘤B细胞间相互作用，CLL细胞和自体活化的T细胞共培养可诱导单核细胞迁移趋化因子CCL3、4、5、22和IL-10 mRNA表达增加。CLL患者外周血分离的血清可使巨噬细胞向肿瘤支持细胞M2型分化。与巨噬细胞接触后CLL细胞内Akt信号通路活化，抗凋亡蛋白Mcl-1表达增加。法国IUC Toulouse Oncopole的Ysebaert等发现CLL微环境中呵护样细胞(NLC)促进CLL细胞对BTK抑制剂依鲁替尼耐药。自依鲁替尼处理过的CLL原代细胞中分离的单核细胞仍能分化成肿瘤支持细胞M2型NLC，促进依鲁替尼耐药。苯达莫司汀联合依鲁替尼处理CLL细胞可克服NLC对CLL的支持效应，提示联合用药可能阻断微环境与CLL细胞相互作用。
外泌体(exosome)是细胞主动向胞外分泌的纳米级小囊泡。由肿瘤细胞释放的外泌体在细胞间物质和信号传导中起重要作用，影响肿瘤的生长、转移和血管新生。乌拉圭Institut Pasteur de Montevideo的Sotelo等从5例进展型CLL(诊断和进展时)和5例非进展型CLL(诊断和无进展4年时)患者血浆中分别纯化分离出外泌体，经液相色谱法／质谱分析法分析其蛋白组学特征，发现参与细胞信号传导和增殖的3种蛋白(S100-A9、斑珠蛋白及硫氧还蛋白)仅出现在进展型CLL患者的外泌体，其中S100-A9参与NF-κB通路的活化，提示外泌体可以作为CLL细胞与微环境之间信号交流的桥梁，在CLL疾病进展中起重要作用。
二、流式细胞术在CLL患者微小残留病(MRD)检测中的应用
在德国CLL8试验中，CLL患者外周血或骨髓的MRD水平能很好地预测其接受FCR[氟达拉滨、环磷酰胺联合利妥昔单抗(RTX)]方案化疗后的PFS。奥地利Paracelsus University Salzburg的Egle等对多中心AGMT-CLL8试验中接受含RTX化疗方案治疗的CLL患者MRD动态变化与预后关系进行回顾性分析。发现86例患者中6个月时MRD与基线MRD比值(MRD-R6)升高(>20)者的PFS时间较未升高者明显缩短(P<0.001)，且MRD-R6为独立的预后因素，与IGHV突变状态、细胞遗传学(FISH检查结果)、一线或二线治疗方案、化疗反应以及MRD在外周血或骨髓基线水平无关。来自法国CLL-MRD工作组的研究者提出了8色9抗体(CD20、CD45、CD81、CD22、CD79b、CD5、CD19、CD200、CD43)流式细胞术检测MRD方案使得最小检测阈值降至0.3×10−6，提高了流式细胞术检测MRD的特异性。
三、中国CLL的研究进展
徐卫等发现初诊时EBV拷贝数阳性CLL患者与更高的血清铁蛋白和胸苷激酶1水平、IGHV无突变、升高的CD20和CD148荧光强度以及ZAP70表达增加相关。EBV阳性患者相比阴性患者更容易发生Richter转化，至首次治疗时间(TTT)和OS时间均缩短(P值分别为0.014和0.019)。化疗3个周期后由初诊时阳性转为阴性患者的OS率优于持续阳性患者(P<0.01)。徐卫等在另一项有关HBV的回顾性研究中发现，329例CLL患者中有54例(16.4%)初诊时即有慢性HBV感染(HBsAg+或HBsAg−/HBcAb+)，这些患者在接受化疗后，HBV再激活发生率在HBsAg+患者为30%(6/20)，HBsAg−/HBcAb+患者为14.7%(5/34)。这11例发生HBV再激活的患者中仅有2例(18.2%)在化疗期间进行预防性抗HBV。CLL临床指标如低血红蛋白、高乳酸脱氢酶、高丙氨酸转氨酶、高血清铁蛋白、高CD38表达、TP53异常、无预防性抗HBV治疗、含RTX和氟达拉滨方案均与HBV再激活相关。此外，HBV再激活有更大的可能转为Richter综合征，且发生再激活的患者TTT更短(P=0.028)。范磊等采用流式细胞术检测CD200在B细胞慢性淋巴增殖性疾病(B-CLPD)患者中的表达，发现CD200在CLL患者中的荧光强度明显高于其他B-CLPD患者。CD200荧光强度<189.5的CLL患者较≥189.5者TTT显著缩短(P=0.0008)。此外吴佳竹等发现CLL患者CD8+T细胞PD-1表达增加与其增强子区域CpG位点的甲基化下降有关，同时采用全基因组DNA甲基化检测法进一步分析了CLL患者和正常对照者CD8+ T细胞甲基化水平的差异。李姮等对13q−缺失片段大小(FISH探针RB1和D13S25)与B-CLPD患者预后进行了相关性分析，研究发现13q−大片段缺失者的TTT和OS时间均短于小片段缺失者(P<0.05)。夏奕等采用大剂量甲泼尼龙(HDMP)、RTX联合新鲜冰冻血浆(FFP)治疗(2单位FFP+RTX 375 mg/m2治疗开始时，HDMP 1.0 g·m−2·d−1，第1~5天，28 d为1个周期)16例TP53异常的B-CLPD患者，总反应率和完全缓解(CR)率分别为81.3％和37.5%，至最后一次随访，CR患者无一例出现疾病进展，而部分缓解(PR)患者中位PFS时间为11个月。1例PR患者行异基因造血干细胞移植后26个月仍为CR。提示该方案对TP53异常的B-CLPD患者有较好的疗效，但对于处理后对未达到CR患者需进一步积极治疗。
四、CLL的治疗
1．化学免疫治疗：英国LRF CLL4试验中位随访时间为12(10~16)年，是目前随访时间最长的随机试验。777例初治CLL患者(中位年龄65岁)分为F(氟达拉滨)组、Clb(苯丁酸氮芥)组和FC(氟达拉滨＋环磷酰胺)组。614例(79%)患者出现疾病进展，其中524例(67%)接受了二线治疗，260例(33%)接受了三线治疗。三组间患者的OS率差异无统计学意义，FC组较前两组患者PFS期显著延长(P<0.001)，但在疾病进展后OS期明显缩短(P<0.001)。对OS期≥10年的176例(24%)患者进行分析，结果显示年龄<70岁、IGHV突变、至少有1次CR、一线治疗后PFS>3年、接受的治疗方案≤ 2个均为预后良好因素。对于二线治疗接受FC为基础方案(20％联合RTX)或造血干细胞移植的患者较接受其他方案者的10年OS率增加1倍(32％对16%，P<0.001)。
澳大利亚ALLG CLL5工作组探索了减低剂量FCR方案在初治“合适(fit) ”老年CLL患者的安全性和应用价值。116例患者的中位年龄为71岁，28 d为1个周期共6个周期。具体为：FR5方案：氟达拉滨24 mg/m2第1~5天；RTX 375 mg/m2第1天，第1个疗程，500 mg/m2第1天，第2~6个疗程。FCR3方案：氟达拉滨用法同上；环磷酰胺150 mg/m2第1~3天；RTX 375 mg/m2第1天。FCR5方案：氟达拉滨用法同上；环磷酰胺150 mg/m2第1~5天；RTX 375 mg/m2第1天。34％患者完成6个周期的治疗，FCR5方案可耐受性较FR5和FCR3方案差(P<0.001)，3/4级不良反应更常见(P= 0.004)。三组患者的总有效率均达95%，FR5组患者18个月PFS和OS率分别为65％和97%，FCR3组为75％和90%，FCR5组为65％和83%，差异均无统计学意义(P值均> 0.05)。提示减低剂量FCR方案对初治“合适”老年患者安全有效。
美国M.D. Anderson Cancer Center的Thompson等报道了采用R2方案治疗60例初诊CLL患者的Ⅱ期临床试验结果。来那度胺10 mg/m2第9~28天口服，RTX 375 mg/m2第1、8、15、22天静脉滴注，28 d为1个周期。56例可评估治疗患者总有效率为77% (CR率18%、PR率59%)。47％的患者出现3/4级中性粒细胞减少，严重感染不常见且大部分患者在剂量调整和给予生长因子支持治疗后可缓解。4例患者分别出现3级(1例)和2级(3例)燃瘤反应，剂量调整和给予激素治疗可控制此反应。总体上，R2方案治疗初诊CLL患者有良好的疗效和安全性。
2．BCR信号通路抑制剂
(1)BTK抑制剂依鲁替尼：一项随机、双盲、多中心Ⅲ期临床试验HELIOS比较了IBR(依鲁替尼＋苯达莫司汀+ RTX)或BR(苯达莫司汀+RTX)方案治疗非初治CLL患者的疗效。入组患者均无17p−，随机分为两组：IBR组289例，BR联合安慰剂组289例，中位随访时间17个月。结果显示，与BR联合安慰剂组比较，IBR组患者PFS率较高，包括有预后高危因素亚组(既往化疗方案>1次、IGHV无突变、嘌呤类似物耐药、包块>5 cm)者结果也是一致；IBR组患者的病死率可降低42%。IBR组和BR联合安慰剂组患者出血发生率分别为31％和14.6%(大部分为1级，且发生与治疗时间长短无关)，腹泻发生率分别为35.5％和23.3%。两组患者第二肿瘤发生率差异无统计学意义，少数出现视力障碍，但3级视力损害发生率很低(<1.5%)。
(2)PI3K抑制剂：美国Memorial Sloan-Kettering Cancer Center的Zelenetz等报道了Idelalisib(IDELA)单药治疗41例初治老年(≥65岁)CLL或小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)患者的Ⅱ期临床试验，口服IDELA 150 mg每天2次。中位IDELA服用时间为9.3(1.4~17.4)个月，总有效率达85.0% (PR率70.7%)。6例TP53异常的患者总有效率达83.0%。在24例可评估疗效的患者中，92％出现脾大。基线中位淋巴细胞计数为62.3×109/L，而治疗后4个月达峰值88.2×109/L。除淋巴细胞增多外，常见转氨酶升高和中性粒细胞减少。最常见的严重不良反应为腹泻(66.0%)。提示IDELA单药在老年CLL患者耐受性良好且有一定的疗效。
美国The Ohio State University的Awan等比较了PI3K/mTOR抑制剂voxtalisib(30 mg或50 mg，每日2次)联合RTX(RV方案)或BR(BRV方案)对复发或难治的惰性B细胞非霍奇金淋巴瘤(NHL)、套细胞淋巴瘤(MCL)或CLL患者的安全性和疗效。常见3级以上不良反应为血小板计数降低，仅出现在BRV方案治疗组患者。可评估的35例患者中4例(11.4%)获CR, 13例(37.1%)获PR。Duvelisib(IPI-145)是一种新型口服PI3K-δ/γ抑制剂，55例复发／难治CLL/SLL患者入组DuvelisibⅠ期临床试验，中位年龄66岁，IGHV无突变者占89%，TP53突变或17p−占52%。25 mg或75 mg Duvelisib可持续抑制肿瘤细胞pAKT (S473)而致细胞凋亡，且对CLL细胞增殖的抑制作用呈非剂量依赖型。25 mg Duvelisib(每日2次口服)总有效率达57%，2年PFS率和OS率分别为59％和63%。不良反应大多数为可逆的1 /2级，最常见导致化疗中止的不良反应是肺炎、腹泻及口腔炎。Duvelisib对复发／难治CLL/SLL患者有良好疗效，另一项随机Ⅲ期临床试验为对比25 mg Duvelisib和奥法木单抗在复发／难治CLL患者的疗效，目前正在进行中。
3．其他治疗方案：PIM是高度保守的丝氨酸／苏氨酸促癌激酶，在CLL细胞中过表达。澳大利亚Kolling Institute of Medical Research的Best等在体外模拟缺氧或CD40L纤维母细胞共培养的微环境，PIM/PI3K抑制剂IBL-202对CLL细胞有剂量依赖性细胞毒作用。另一种小分子IKKα抑制剂可以通过下调CD40L诱导参与调控基因转录的非经典NF-κB通路中NF-κB亚单位RelB和p52核内聚集，抑制p100蛋白磷酸化进而抑制CLL细胞增殖。
随着对CLL微环境的深入研究，阻滞微环境对CLL细胞的支持作用为治疗提供了新的选择。CLL细胞表面高表达CXCR4，PF-06747143是其IgG1抗体。体外实验证明PF-06747143能阻断与微环境连接的CXCR4-CXCL12轴而抑制细胞迁移，并可以通过补体依赖细胞毒反应(CDC)和抗体依赖细胞毒作用(ADCC)促进CLL细胞凋亡。PF-06747143与氟达拉滨、RTX、苯达莫司汀共同处理CLL细胞时均有很好的协同效应。单核／巨噬细胞系统参与了CLL的病理过程，CLL特异的肿瘤相关巨噬细胞是微环境中NLC的来源。意大利IRCCS San Raffaele Scientific Institute的Bertilaccio等分析接触CLL细胞后的单核／巨噬细胞，发现IL-10、RNASET2、NOTCH1、BIRC3、PTEN等基因表达水平升高。研究者通过介导巨噬细胞内化的氯膦酸盐脂质体clodrolip干预后发现CLL细胞凋亡和坏死增加。CSF-1是肿瘤相关巨噬细胞重要的生存因子，小鼠体内试验证实CSF-1R单抗能有效减少巨噬细胞，促进肿瘤细胞凋亡，而这一效应可在CLL患者外周血单个核细胞体外实验中得到验证。