伴FGFR1异常的髓系和淋巴系肿瘤又称8p11骨髓增殖综合征（EMS），是一种罕见的侵袭性血液肿瘤，其致病机制主要为定位于染色体8p11的FGFR1基因发生断裂重排，与不同的对手基因形成融合，最终导致FGFR1的酪氨酸激酶异常激活，从而使正常造血细胞发生恶性转化[1]。2008年，8p11/FGFR1重排被作为特异性分类标志纳入WHO髓系与淋巴组织肿瘤分型。目前，国内外报道的FGFR1对手基因共有15种，最常见的为位于13q12的ZNF198，而MYO18A非常罕见，国内尚未检索到文献报道，国外仅报道1例，且无分子克隆研究[2]。现我们报告1例t（8;17）（p11;q23）/MYO18A-FGFR1阳性EMS患者，并对其受累基因进行全长克隆及鉴定。
病例资料
患者，男，52岁。2015年7月因乏力不适至当地医院查血常规示WBC 62.0×109/L、HGB 13.9 g/L、PLT 411×109/L。后多次复查血常规均提示白细胞明显升高，遂就诊于我院。查体：浅表淋巴结未触及肿大；扁桃体无肿大；胸骨无明显压痛，肝肋缘下未及，脾肋缘下3横指，质地中等。骨髓象：增生明显活跃，粒系占0.670，形态大致正常，嗜酸性粒细胞8%，嗜碱性粒细胞4%；红系占0.210，比例及形态大致正常，淋巴细胞占0.075，全片巨核细胞>100个，血小板大、中、小簇均可见。染色体核型：t（8;17）（p11;q24）。多重PCR未检测到29种常见白血病融合基因；FISH示FGFR1基因重排阳性。二代测序联合DNA-PCR未检测到常见51种肿瘤基因突变；转录组测序提示t（8;17）（p11;q23）相应受累基因分别为位于8p11上的FGFR1及位于17q24上的MYO18A；应用MY018A及FGFR1特异性引物（上游引物：5′-AGATAGTGAGGAGAGTCAGCG-3′，下游引物：5′-GTTGTAGCAGTATTCCAGCCC-3′）进行RT-PCR扩增，可见一清晰条带，经测序证实为MYO18A-FGFR1融合基因产物（图1），其断裂位点分别位于MYO18A的31号外显子和FGFR1的10号外显子（图2）。综合临床表现及实验室检查，按照2008年WHO髓系与淋巴系肿瘤分型标准，诊断为“考虑伴有FGFR1重排EMS”。患者拒绝静脉化疗，予干扰素皮下注射（300万U，每周3次），并根据白细胞水平不规律口服羟基脲，WBC（5~11）×109/L，但脾脏回缩不明显。2016年9月出现间断齿龈出血，复查骨髓象后诊断为“急性淋巴细胞白血病”。予以VP方案（长春地辛+泼尼松）诱导化疗，化疗结束2周复查骨髓未缓解。患者因病程中出现肺部感染，未再进一步诱导，于白血病转化3个月后死于疾病进展。
图1. RT-PCR检测MYO18A-FGFR1融合基因.
M：DNA Marker；1：正常阴性对照；2：MYO18A-FGFR1融合基因特异性产物（1 048 bp）
图2. 测序证实MYO18A和FGFR1的融合位点分别位于MYO18A的31号外显子及FGFR1的10号外显子.
为进一步研究MYO18A-FGFR1融合基因功能，我们以患者cDNA为模板，用含有重叠序列的8对引物（表1），通过KOD高保真酶（日本TOYOBO公司产品）进行全长扩增，得到的8个片段共同为模板，得到的产物在15 g/L的琼脂糖上进行电泳，观察到330、828、1 121、1 245、1 223、1 184、826和596 bp的目的片段（图3），与预期的片段大小一致。以8个片段的混合物为模板，以最外侧引物进行PCR扩增，产物在15 g/L琼脂糖凝胶上观察得到6 006 bp的目的条带（图4），TA克隆并克隆测序分析该融合基因保留了MYO18A的PDZ结构域和FGFR1的酪氨酸激酶结构域（图5）。
表1. MYO18A-FGFR1融合基因分段扩增引物的碱基位置、序列、退火温度及片段大小.
| 引物名称（碱基位置） | 序列（5′→3′） | 退火温度（°C） | 片段大小（bp） |
| F1（1） | 上游引物：ATGTTTAACCTAATGAAGAAAGACAAGGACA | 60 | 330 |
| R1（330） | 下游引物：CTCCTCACCCTTGAGGTCATCG | 59 | |
| F2（225） | 上游引物：CCTGCACCTGACTGACATTGACT | 60 | 828 |
| R2（1052） | 下游引物：TTCTCCGTCTCATTCCAGGCCTC | 61 | |
| F3（918） | 上游引物：GGTGCAGCCCATTCCAGAG | 59 | 1 121 |
| R3（2038） | 下游引物：CTTTGGTGGCTCCCGCA | 59 | |
| F4（1835） | 上游引物：AGCTCCACCTCAACCACTTGG | 60 | 1 245 |
| R4（3079） | 下游引物：GCTTCATCTGGATGCACAGTGACT | 60 | |
| F5（2904） | 上游引物：AATCATCAGCAACCTGTTTCTGGG | 59 | 1 223 |
| R5（4126） | 下游引物：CATACTTCAGCCGCCACTCG | 59 | |
| F6（4028） | 上游引物：TGGAAATGGAGGTGATGGAGGC | 60 | 1 184 |
| R6（5211） | 下游引物：ATACAAGGGACCATCCTGCGTG | 60 | |
| F7（4766） | 上游引物：AGATGGAGAGTCGGGATGAGGAG | 60 | 826 |
| R7（5591） | 下游引物：GACCACACATCACTCTGGTGGG | 60 | |
| F8（5411） | 上游引物：CAGCCAGGAATGTCCTGGTGA | 60 | 596 |
| R8（6006） | 下游引物：TCAGCGGCGTTTGAGTCC | 59 |
图3. 重叠PCR扩增后电泳结果.
M：DNA Marker；1~8为分别为引物F1R1、F2R2、F3R3、F4R4、F5R5、F6R6、F7R7、F8R8扩增产物
图4. MYO18A-FGFR1全长融合基因特异性产物.
M：DNA Marker；1：外侧引物扩增的MYO18A-FGFR1全长融合基因特异性产物（6 006 bp）：2：对照
图5. 经克隆测序及比对分析的MYO18A-FGFR1融合蛋白结构示意图.
1：lys-rich；2：Interactin with acting；3：SH3-like；4：IQ
讨论及文献复习
EMS是一种罕见的、具有高的白血病转化率的侵袭性血液肿瘤，平均白血病转化时间仅为4.2个月[1]，可见于任何年龄。常见临床表现包括乏力（35%）、盗汗（28%）、消瘦（18%）及发热（13%），分别有48%、15%的患者伴随全身淋巴结、局部淋巴结肿大，但纵隔淋巴结肿大并不常见；分别有58%、32%的患者伴有脾肿大、肝肿大，约28%的患者同时伴有肝脾肿大；主要实验室特征为：白细胞计数明显增高、骨髓中髓系高度增生、嗜酸细胞增多等[1]。
不同的FGFR1对手基因致EMS的临床表现不同，如伴t（8;13）（p11;q12）/ZNF198-FGFRl阳性患者常表现为淋巴结肿大和T淋巴母细胞淋巴瘤[7]；伴t（8;22）（p11;ql1）/BCR-FGFRl阳性患者常呈现出白细胞增多、中性粒细胞增多、嗜碱性粒细胞增多等慢性髓性白血病（CML）样表现[3]；伴t（8;9）（p11;q34）/CEP110-FGFRl阳性患者则常表现为皮疹、扁桃体肿大及单核细胞增多等[8]。伴t（8;17）（p11;q23）/MYO18A-FGFR1阳性的EMS患者目前国内外仅检索到1例文献报道，该患者为74岁老年女性，有类似CML病史两年，主要临床表现为反复发热、盗汗及3个月内体重减轻5 kg，骨髓形态学提示单核细胞、嗜酸细胞及嗜碱细胞增多[2]。本例患者慢性期病史1年，临床表现与既往报道类似，并在诊断1年后转化为急性淋巴细胞白血病。
既往研究显示，EMS的发病与FGFR1基因密切相关。FGFR1基因编码的相关蛋白是受体酪氨酸激酶家族成员之一，有3个免疫球蛋白样结构域，一个跨膜区和一个胞内酪氨酸激酶结构域，在非激活状态时以单体形式存在[9]。当FGFR1蛋白胞外受体与相应配体结合后可发生构象变化并诱发二聚化，从而激活下游信号传导途径，在调节细胞增殖、凋亡、迁移和细胞表型转化等方面发挥重要作用[10]。当FGFR1基因发生断裂重排时，保留胞内的酪氨酸激酶结构域，并与伙伴基因（如ZNF198）相互易位形成新的融合基因，干扰了FGFR1正常功能并使伙伴基因的正常功能丧失[11]。将FGFR1相关融合基因如ZNF198-FGFR1转染至Ba/F3细胞后，该细胞产生IL-3非依赖性生长，并使小鼠移植模型产生EMS临床表型[12]。
MYO18A基因定位于染色体17q24，约109 kb，其N段有PDZ结构域，该结构域能使蛋白之间相互作用，C段富含Coiled coil结构域，可介导蛋白间的相互作用，参与细胞的多项重要生命活动[13]。既往研究表明，MYO18A基因有多种剪切形式，在多种组织中广泛表达。MYO18A可与高尔基体分泌面膜上的GOLPH3结合，从而形成MYO18A/GOLPH3复合物，该复合物可促进高尔基体分泌面膜上分泌的液泡向细胞膜的转运，有证据表明MYO18A/GOLPH3复合物可增加细胞对DNA损伤的修复作用[14]。最近研究显示，MYO18A可通过结合高尔基体分泌面膜上的GOLPH3促进肿瘤的发生[15]。以上研究发现为肿瘤靶向治疗提供了新的分子靶点。本研究对MYO18A-FGFR1融合基因进行全长克隆及结构分析发现，MYO18A保留了PDZ结构域，FGFR1保留了酪氨酸激酶结构域，但二者之间的交互性作用机制尚在进一步研究中。近年来，高通量DNA深度测序已开始应用于血液肿瘤的多基因检测，但因EMS发病率低，关于FGFR1以外的协同基因事件尚未见大宗病例报道。Strati等[16]对7例伴FGFR1重排阳性的EMS患者进行深测序发现，78%（5/7）的患者携带RUNX1基因点突变，是最常见的伴随基因突变，但该组病例中无MYO18A-FGFR1阳性患者。本研究综合检测常见51种肿瘤基因突变均阴性，未见伴随基因事件。
目前，EMS尚无有效、统一的治疗方案，针对FGFR1的酪氨酸激酶抑制剂是目前研究的热点。Chase等[17]报道酪氨酸激酶抑制剂TKI258，通过抑制融合基因FGFR1激酶和下游通路活性，有效抑制转染ZNFl98-FGFR1和BCR-FGFR1的Ba/F3细胞增殖、也可抑制FGFR1OP2-FGFR1阳性的EMS细胞株KG-1的增殖和生长并促进其凋亡。Landberg等[18]对伴有BCR/FGF1阳性的EMS患者原代细胞进行药物抑制性研究，结果显示，ponatinib、TKI258及dasatinib均显示出较好的抑制效应。Verstovsek等[19]报道了1例伴CEP110-FGFR1阳性50岁男性患者，在口服FGFR1酪氨酸激酶抑制剂INCB054828后达完全分子学缓解，且耐受性良好。我们既往研究显示，小分子酪氨酸激酶抑制剂BGJ398能有效抑制伴FGFR1OP2-FGFR1阳性的KG-1细胞增殖并诱导其凋亡，抑制FGFR1蛋白表达并下调Bcl-2水平[20]，但尚无EMS患者的临床用药报道。异基因造血干细胞移植仍是目前唯一有潜在治愈可能的治疗手段。
总之，t（8;17）（p11;q24）阳性的EMS患者同样具有侵袭性临床过程，其相关融合基因MYO18A-FGFR1在EMS中非常罕见，基因克隆分析保留了MYO18A及FGFR1主要功能域，其临床表现类似CML，易被误诊误治，应及时行分子遗传学检测以便尽早诊断。
Funding Statement
基金项目：国家自然科学基金青年基金（81500103）；江苏省自然科学基金面上项目（BK-20151230）；常州市高层次卫生人才培养工程（2016CZLJ027）
References
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