Abstract
目的
研究WT1表达水平对急性白血病异基因造血干细胞移植预后的影响及其作为分子学标志来动态监测微小残留病（MRD）的意义。
方法
回顾性分析2016年1月至2017年12月在浙江大学医学院附属第一医院骨髓移植中心行异基因造血干细胞移植的314例急性白血病患者，男163例，女151例，中位年龄30（9~64）岁，比较初诊时、移植前、移植后WT1表达，通过ROC曲线确定移植前、移植后3个月内及移植后6个月WT1表达量预测复发的临界值分别为1.010%、0.079%、0.375%，根据上述临界值将WT1阳性患者分为低表达组和高表达组，分析移植后总生存（OS）、无病生存（DFS）以及累积复发率（CIR）与WT1表达量之间的关系。
结果
移植前WT1高表达组的OS、DFS率均低于低表达组[69.2%（9/13）对89.1%（57/64），χ2=4.086，P=0.043；53.8%（7/13）对87.5%（56/64），χ2=9.766，P=0.002]，CIR高于低表达组[30.8%（4/13）对7.8%（5/64），P=0.017]。移植后3个月WT1高表达组、低表达组OS、DFS率差异均无统计学意义（P=0.558，P=0.269）。移植后6个月WT1高表达组OS、DFS率均低于低表达组（P=0.049，P=0.035）。多因素分析显示，移植后6个月WT1表达>0.375%是影响DFS的独立危险因素（P=0.022），移植后3个月内及移植后6个月WT1高表达组的复发率与低表达组比较差异无统计学意义（P=0.114，P=0.306）。
结论
移植前及移植后WT1高表达是影响预后的不利因素，将WT1作为急性白血病患者造血干细胞移植的推荐指标和移植后MRD的监测手段存在临床实用价值。
Keywords: 急性白血病, 异基因造血干细胞移植, WT1基因, 微小残留病
Abstract
Objective
To study the effect of WT1 expression on the prognosis of allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (allo-HSCT) in acute leukemia (AL) and its significance as molecular marker to dynamically monitor minimal residual disease (MRD).
Methods
Retrospectively analyzed those AL patients who underwent allo-HSCT in the First Hospital Affiliated to Zhejiang University School of Medicine during Jan 2016 to Dec 2017, a total number of 314 cases, 163 males and 151 females, median age was 30 (9–64) years old. Comparing the difference of WT1 expression at diagnosed, pre-HSCT and after HSCT. Using the receiver operating characteristic (ROC) curve to determine the WT1 threshold at different time so as to predict relapse. The threshold of WT1 expression before transplantation was 1.010%, within 3 months after HSCT was 0.079% and 6 months after HSCT was 0.375%. According to these thresholds, WT1 positive patients were divided into low expression groups and high expression groups. Analyzed the relationship between overall survival (OS), disease-free survival (DFS), cumulative incidence of relapse (CIR) and WT1 expression.
Results
The OS and DFS of high expression group pre-HSCT were lower than low expression group [69.2% (9/13) vs 89.1% (57/64), χ2=4.086, P=0.043; 53.8% (7/13) vs 87.5% (56/64), χ2=9.766, P=0.002], CIR was higher than low expression group [30.8% (4/13) vs 7.8% (5/64), P=0.017]. There was no significant difference of OS and DFS between high expression and low expression group of 3 months after HSCT (P=0.558, P=0.269). The OS and DFS of high expression group of 6 months after transplantation were both lower than low expression group (P=0.049, P=0.035). Multivariate analysis showed that WT1>0.375% when 6 months after transplantation was the only independent prognostic factor for shorter DFS (P=0.022). There was no statistically significant difference in CIR between the high-expression group and the low-expression group 3 months after transplantation and 6 months after transplantation (P=0.114, P=0.306).
Conclusion
High expression of WT1 before and after HSCT was an adverse prognosis factor. It is of clinical practical value to use WT1 as a transplant recommendation index for patients with acute leukemia and as a marker to monitor MRD dynamically.
Keywords: Acute leukemia, Allogeneic hematopoietic stem cell transplantation, WT1 gene, Minimal residual disease
WT1被认为是一种泛表达的白血病基因，80%~90%的急性髓系白血病（AML）患者WT1表达阳性[1]–[4]，可作为微小残留病（MRD）的检测指标之一。近年来许多国外研究报道认为动态监测造血干细胞移植前后WT1表达可预测移植预后。但由于各中心检测方法的差异以及WT1在正常原始细胞中也有低表达，目前临床上还没有明确预测复发的WT1表达临界值。本研究我们回顾性分析2016年1月1日至2017年12月31日在我院行异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）的急性白血病患者，旨在探讨WT1表达量对allo-HSCT预后的影响以及将其作为分子学标志监测MRD的意义。
病例与方法
1．病例：本回顾性研究纳入2016年1月1日至2017年12月31日在浙江大学附属第一医院骨髓移植中心行allo-HSCT的314例急性白血病患者。
2．WT1的检测：应用逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）方法进行标本测定，包括提取标本RNA、逆转录合成cDNA、PCR扩增、PCR的产物分析，WT1表达水平（%）=（WT1拷贝数/内参基因ABL拷贝数）×100%。检出WT1拷贝即认为是阳性。通过ROC曲线制定不同时间点WT1预测复发的临界值：分别选取移植前、移植后3个月、移植后6个月WT1检测结果以及复发情况来绘制ROC曲线。移植前WT1=1.010%，ROC曲线下面积（AUC）为0.661，预测复发的敏感度为55.6%，特异度为86.8%；移植后3个月内WT1=0.079%时AUC为0.531，敏感度为85.7%，特异度为31.0%；移植后6个月WT1=0.375%，AUC为0.491，敏感度为40.0%，特异度为81.8%。根据如上ROC曲线，将移植前WT1高表达定义为WT1>1.010%，移植后3个月内WT1高表达定义为WT1>0.079%，移植后6个月WT1高表达定义为WT1>0.375%。
3．随访：采用门诊及电话随访方式。随访截至2018年3月1日，中位随访时间为332.5（30~787）d。复发：骨髓原始细胞比例>0.050或出现髓外浸润。总生存（OS）期：造血干细胞回输至死亡或随访截止的时间。无病生存（DFS）期：造血干细胞回输至疾病复发或死亡的时间。
4．统计学处理：采用SPSS23.0进行统计分析。临床特征分析及比较采用描述性分析，计数资料比较用χ2检验，符合正态分布的计量资料用t检验，非正态分布资料用Mann-Whitney U检验。通过ROC曲线来确定WT1识别复发的最佳临界值。生存曲线采用Kaplan-Meier法，两组生存曲线比较采用Log-rank检验，多因素分析采用Cox回归模型。累积复发率通过竞争风险模型分析，认为非复发死亡（NRM）是复发的竞争事件。P<0.05被认为差异有统计学意义。
结果
1．一般资料：纳入本研究的314例急性白血病患者中，男163例，女151例，中位年龄30（9~64）岁。初诊时WT1表达阳性、阴性分别为93、221例，两组年龄、性别、疾病类型、危险分层、移植类型差异无统计学意义，WT1阳性组移植前处于第1次完全缓解（CR1）状态患者比例高于阴性组（80.6%对67.0%，χ2=5.949，P=0.015），详见表1。
表1. WT1阳性组与阴性组急性白血病患者的临床特征比较.
| 移植患者特征 | WT1阳性组（93例） | WT1阴性组（221例） | 统计量 | P值 |
| 年龄［岁，M（范围）］ | 30（14～60） | 31（9～64） | t＝0.094 | 0.925 |
| 性别［例（%）］ | χ2=1.120 | 0.323 | ||
| 男 | 44（47.3） | 119（53.8） | ||
| 女 | 49（52.7） | 102（46.2） | ||
| 疾病类型［例（%）］ | χ2=8.500 | 0.386 | ||
| AML-M0 | 3（3.2） | 8（3.7） | ||
| AML-M1 | 7（7.5） | 10（4.5） | ||
| AML-M2 | 23（24.7） | 42（19.0） | ||
| AML-M4 | 1（1.1） | 14（6.3） | ||
| AML-M5 | 18（19.4） | 44（19.9） | ||
| AML未分类 | 2（2.2） | 3（1.4） | ||
| ALL | 35（37.6） | 84（38.0） | ||
| AL混合型 | 3（3.2） | 6（2.7） | ||
| MDS转AL | 1（1.1） | 10（4.5） | ||
| 移植类型［例（%）］ | χ2=0.935 | 0.626 | ||
| 单倍型 | 66（70.9） | 156（70.6） | ||
| 亲缘全相合 | 21（22.6） | 44（19.9） | ||
| 非亲缘 | 6（6.5） | 21（9.5） | ||
| 移植前疾病状态［例（%）］ | χ2=5.949 | 0.015 | ||
| CR1 | 75（80.6） | 148（66.9） | ||
| CR2及以上 | 18（19.4） | 73（33.1） | ||
| 危险分层［例（%）］ | χ2=2.736 | 0.129 | ||
| 高危 | 68（73.1） | 180（81.4） | ||
| 标危 | 25（26.9） | 41（18.6） |
注：AL：急性白血病；AML：急性髓系白血病；ALL：急性淋巴细胞白血病；MDS：骨髓增生异常综合征。CR1、CR2分别为第1、2次完全缓解
2．初诊WT1阳性对移植预后的影响：至随访截止，WT1阳性组死亡13例，其中复发死亡8例、非复发死亡5例；WT1阴性组死亡33例，其中复发死亡23例、非复发死亡10例。WT1阳性组、阴性组OS率、DFS率差异均无统计学意义[86.0%（80/93）对85.1%（188/221），χ2=0.035，P=0.851；81.7%（76/93）对79.2%（175/221），χ2=0.030，P=0.861]。移植后复发人群的中位复发时间为216（103~289）d，阳性组与阴性组累积复发率（CIR）差异亦无统计学意义[16.7%（37/221）对12.9%（12/93），P=0.505，HR=0.774（95% CI 0.395~1.518）]。
3．化疗、移植对WT1表达量的影响：WT1阳性组93例患者初诊WT1的中位表达量为3.945%（0.008%~61.000%）；16例在初诊后未规律监测WT1表达，其余77例患者化疗后移植前WT1的中位表达量为0.170%（0.008%~54.000%），低于初诊WT1表达量（z=6.919，P<0.001）；67例患者有移植后WT1检测结果，移植后3个月WT1中位表达量为0.120%（0.014%~107.000%），低于移植前（z=2.324，P=0.020）；移植后6个月WT1中位表达量为0.160%（0.020%~69.000%），与移植前比较差异无统计学意义（z=0.619，P=0.536）
4．移植前WT1高表达对预后的影响：移植前有WT1检测数据的患者共77例，根据上述ROC曲线所得移植前WT1临界值1.010%，将WT1阳性组分为高表达组（13例）与低表达组（64例）。高表达组的OS、DFS率均低于低表达组[69.2%（9/13）对89.1%（57/64），χ2=4.086，P=0.043；53.8%（7/13）对87.5%（56/64），χ2=9.766，P=0.002]（图1）。高表达组CIR高于低表达组[30.8%（4/13）对7.8%（5/64），P=0.017，HR=5.303（95% CI 1.343~20.941）]。
图1. 移植前WT1表达量对急性白血病患者allo-HSCT总生存（A）和无病生存（B）的影响.
5．移植后WT1高表达对预后的影响：67例患者有移植后3个月WT1检测结果，根据ROC曲线临界值0.079%分为高表达组（48例）、低表达组（19例），两组OS、DFS率差异均无统计学意义[87.5%（42/48）对94.7%（18/19），χ2=0.344，P=0.558；81.3%（39/48）对89.5%（17/19），χ2=1.221，P=0.269]，CIR差异亦无统计学意义[16.7%（8/48）对5.3%（1/19），P=0.114，HR=2.909（95% CI 0.773~10.943）]。
38例患者有移植后6个月WT1检测结果，按ROC曲线临界值0.375%分为高表达组（8例）、低表达组（30例），高表达组OS、DFS率均低于低表达组[75.0%（6/8）对93.3%（28/30），χ2=3.883，P=0.049；62.5%（5/8）对86.7%（26/30），χ2=4.433，P=0.035]（图2），CIR差异无统计学意义[25%（2/8）对10%（3/30），P=0.306，HR=2.492（95% CI 0.434~14.317）]。将危险分层、移植前疾病状态、移植前WT1是否>1.010%及移植后6个月WT1是否>0.375%纳入多因素分析，结果显示，移植后6个月WT1表达>0.375%是影响DFS的独立危险因素（P=0.022）。
图2. 移植后6个月WT1表达量对急性白血病患者异基因造血干细胞移植总生存（A）和无病生存（B）的影响.
讨论
目前MRD的监测手段主要包括流式细胞术（FCM）、聚合酶链反应技术（PCR）、荧光原位杂交技术（FISH）、染色体核型分析等方法。由于WT1突变近年来被发现在急性白血病中广泛表达，因此用WT1作为标记基因来监测MRD越来越受到研究者的重视。
WTl基因是1990年由Call等[5]从儿童肾脏Wilms瘤细胞中分离出来，定位于人类染色体11p13。其表达水平与白血病的发生、发展及预后的关系被多数研究证实[6]–[7]，早年也有研究认为WT1是白血病预后的有利因素[8]。WT1在正常造血祖细胞中也有低表达，因此在正常人群及CR期白血病患者中也可检测到WT1表达[1]，加之各中心WT1测定方法不同，国内外所报道的可以预测移植后复发的WT1基因的表达水平也各不相同[9]–[12]，移植前WT1的表达水平对于预后的影响更无明确的阈值。Candoni等[3]研究了122例CR期行allo-HSCT的初诊WT1阳性（>250拷贝/µg RNA）急性白血病患者，结果显示移植前WT1阳性组OS及DFS明显低于阴性组，而RR明显高于阴性组，多因素分析显示移植前WT1表达阴性是提高OS及DFS的独立预后因素；Nomdedéu等[12]研究显示移植前、移植后WT1表达<100拷贝/µg RNA的患者有较好的OS、DFS以及较低的CIR。Ino等[9]则将研究人群分成<50、50~500、>500拷贝/µg RNA三组，结果显示移植前、+30 d及+60 d WT1表达水平对OS、DFS、CIR有影响，多因素分析显示移植前、+60 d WT1>500拷贝/µg RNA及+30 d WT1>50拷贝/µg RNA与较高的CIR有关，+60 d WT1>500拷贝/µg RNA是OS的独立危险因素。
本研究首先根据初诊WT1结果将患者分WT1阳性与阴性组，两组OS、DFS及累积复发率差异无统计学意义，提示单纯以初诊时WT1是否阳性并不能敏感评估预后，需要更敏感的评价指标才可能有助于预后判定。
本研究选取移植前、移植后血常规恢复稳定的3个月及移植后6个月作为观察点，根据ROC曲线将移植前WT1临界值设定为1.010%，移植后3个月内WT1临界值则设定为0.079%，移植后6个月WT1临界值设为0.375%，以此将WT1阳性患者分为高表达组与低表达组。结果显示移植前WT1高表达组的OS、DFS明显低于低表达组（P=0.043，P=0.002），CIR明显高于低表达组（P=0.017）。移植后6个月WT1高表达组的OS、DFS明显低于低表达组（P=0.049，P=0.035）。移植后3个月及移植后6个月WT1高表达组的复发率差异无统计学意义，这可能与本研究患者总体随访时间较短有一定关系。多因素分析显示，移植后6个月WT1>0.375%是影响DFS的独立危险因素。本研究全部314例患者中248例为高危患者，初诊WT1阳性患者中高危患者占73.1%（68/93），标危患者数量过少可能导致本研究中危险分层并没有显示对结局的明显影响。
本研究比较了初诊时、移植前、移植后3个月内及移植后6个月WT1表达情况，从结果中可得知化疗可以降低WT1的表达量，但仍有16.9%（13/77）的患者在移植前WT1表达量仍在较高表达状态（WT1>1.010%），这部分患者即使接受移植，在移植后仍是复发的高危人群，因此对于那些化疗后WT1持续高表达的患者推荐尽早行造血干细胞移植，移植后应密切随访，尽早干预以降低复发风险。
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