鹿龙再生汤对重型再生障碍性贫血小鼠CD4⁺CD25⁺调节性T细胞内Foxp3表达的影响

多数再生障碍性贫血(AA)由活化或功能亢进的T淋巴细胞作用于造血干／祖细胞，导致造血细胞凋亡及骨髓造血功能衰竭[1]–[2]，而调节性T细胞(Treg)在其发病过程中起重要作用[3]。有研究发现下调Foxp3基因，小鼠体内Treg细胞数量下降，调节功能缺陷[4]。相关研究也表明Akt及Stat3的磷酸化水平与Foxp3蛋白的表达存在密切联系[5]–[6]。鹿龙再生汤是我国著名老中医朱良春先生治疗AA的经验方且效果良好[7]，但未见其细胞和分子水平的研究。本研究我们通过分析中药鹿龙再生汤对SAA小鼠模型CD4⁺CD25⁺ Treg细胞Foxp3表达的影响及Akt、Stat3磷酸化水平的变化，从分子水平探讨鹿龙再生汤治疗AA可能的作用机制。

对象和方法

1．研究对象：近交系雌性BALB/c小鼠，清洁级，8~12周龄，体重18~22 g，由南通大学医学院实验动物中心提供，合格证号：SCXK(苏)2012-0031。BALB/c重型AA模型小鼠参照文献[8]，通过白消安灌胃及腹腔注射IFN-γ 10 d诱导建立。

2．实验分组：将鹿龙再生汤中药原液浓缩10倍，为浓缩液。取40只重型AA模型小鼠，随机分为4组，每组10只，分别予浓缩液、1:5灭菌蒸馏水稀释液、1:10灭菌蒸馏水稀释液及灭菌蒸馏水灌胃5 d，设为AA中药大剂量组、AA中药中剂量、AA中药小剂量组及AA组；另取10只正常BALB/c小鼠作为正常组，予灭菌蒸馏水灌胃15 d。各组灌胃量均为0.01 ml/g。

3．仪器和试剂：小鼠源性重组IFN-γ购自美国Peprotech公司；白消安片购于英国GSK公司；鹿龙再生汤由南通大学附属医院中医科配制；小鼠淋巴细胞分离液购自天津市灏洋生物公司；异硫氰酸荧光素(FITC)标记的抗鼠CD4抗体(CD4-FITC)、藻红蛋白(PE)标记的抗鼠CD25抗体(CD25-PE)、PE-Cy5标记的抗鼠Foxp3抗体(Foxp3 PE-Cy5)、相应的同型阴性对照抗体(Rat IgG1-PE)、固定破膜剂和破膜剂缓冲液均购自美国eBioscience公司；小鼠CD4⁺CD25⁺ Treg细胞分选试剂盒、小鼠FITC-CD4抗体、免疫磁珠分选缓冲液、免疫磁珠mini、midi分选器均购于德国Miltenyi公司；Western blot全套仪器购自美国Bio-Rad公司；兔抗小鼠β-actin、Akt、磷酸化(p)-Akt、Stat3及p-Stat3抗体均购自美国CST公司；山羊抗兔二抗购自美国Jackson公司。

4．标本采集：采集各组小鼠的眶后静脉血1.0 ml (EDTA抗凝)，分离获得单个核细胞；处死小鼠，无菌取小鼠脾脏，制备成脾细胞悬液，分离获得单个核细胞。

5．Treg细胞的检测：取100 µl制备好的单个核细胞悬液(1×10⁷/ml，单只小鼠)于流式管中，同时设定同型对照管(分别为CD25及Foxp3的对照管)，试验管和Foxp3的对照管中加入CD4-FITC、CD25-PE各5 µl，CD25的对照管中加入CD4-FITC、CD25的同型对照Rat IgG1-PE 5 µl，混匀，室温避光孵育15~30 min后洗涤，258×g离心5 min，弃上清后加入新鲜配制的固定／破膜液，混匀，4 °C避光孵育30~60 min，用固定／破膜缓冲液洗涤后加入正常大鼠血清，4 °C避光封闭15 min，试验管加入Foxp3 PE-Cy5 10 µl，对照管加入Foxp3的同型对照Rat IgG2a-PE-Cy 10 µl，混匀，4 °C避光孵育60 min，用固定／破膜缓冲液2 ml洗涤1次，弃上清后重悬细胞，上流式细胞仪进行检测。实验重复3次。

6．Treg细胞的分选：取400 µl单个核细胞悬液(细胞密度为2.5×10⁸/ml，多只小鼠富集)加100 µl Biotin-Antibody Cocktail轻轻混匀，置于4 °C避光孵育10 min，再分别加入300 µl缓冲液，200 µl Anti-Biotin MicroBeads和100 µl CD25-PE抗体，轻轻混匀，4 °C避光孵育15 min后加入10 ml缓冲液，402×g离心10 min后重悬于500 µl缓冲液中备用，用midi分选器分选获得纯度较高的CD4⁺细胞悬液，离心后重悬于900 µl缓冲液中，再加入100 µl Anti-PE MicroBeads轻轻混匀，4 °C避光孵育15 min，离心后重悬于500 µl缓冲液中，用mini分选器两次分选获得纯度较高的CD4⁺CD25⁺ Treg细胞悬液，调整细胞密度至1×10⁶/ml备用。

7．Western blot法检测Akt、p-Akt、Stat3、p-Stat3的表达水平：离心收集1×10⁶个CD4⁺ CD25⁺ Treg细胞，加入20 µl细胞组织快速裂解液＋苯甲基磺酰氟(按100:1混匀)，冰上裂解30 min, 4 °C离心20 min，测定蛋白浓度后剩余蛋白上清液以4:1的浓度加入SDS上样缓冲液(5×)混匀于沸水煮8 min；配制10％的分离胶、5％的浓缩胶、电泳液、封闭液、转膜液及TBST(1×)等；调整蛋白浓度，依次上样为Marker、正常组、AA组、AA中药小剂量组、AA中药中剂量组及AA大剂量组各20 µl；100 V电泳15 min后调至150 V电泳40 min；15 V转膜40 min后封闭90 min，TBST(1×)洗涤5 min, 4 °C过夜，次日TBST(1×)洗涤，室温孵育二抗1 h后洗涤，膜上覆ECL发光液后至显影仪上显影。

8．统计学处理：采用SPSS 13.0软件进行统计分析，所有数据用均数±标准差表示，根据方差齐或不齐，组间各均数比较采用t或t¢检验，P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1．结果见表1，正常组、AA中药小剂量组、AA中药中剂量组、AA中药大剂量组外周血及脾脏CD4⁺CD25⁺ Treg/CD4⁺细胞、CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺/CD4⁺细胞及CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺/CD4⁺CD25⁺细胞比例均明显高于AA组(P值均<0.05)。

表1. 重型再生障碍性贫血(AA)模型小鼠外周血和脾脏CD4⁺CD25⁺调节性T细胞(Treg)比例(%，x±s，n=10).

组别	外周血			脾脏
	CD4+CD25+/CD4+细胞	CD4+CD25+Foxp3+/CD4+细胞	CD4+CD25+Foxp3+/CD4+CD25+细胞	CD4+CD25+/CD4+细胞	CD4+CD25+Foxp3+/CD4+细胞	CD4+CD25+Foxp3+/CD4+CD25+细胞
正常组	3.69±0.30	3.57±0.32	95.12±0.29	2.11±0.22	1.85±0.23	87.62±2.25
AA组	2.57±0.35	1.94±0.26	75.23±1.05	1.96±0.60	1.26±0.70	64.01±1.73
AA小剂量组	5.16±0.52	4.54±0.42	87.79±2.68	2.58±0.85	1.85±0.37	71.54±2.82
AA中剂量组	5.52±0.64	4.68±0.60	86.63±2.64	3.15±0.36	2.40±0.40	79.04±6.34
AA大剂量组	6.18±0.57	5.38±0.55	86.81±3.11	3.08±0.54	2.16±0.23	71.28±5.57

注：AA组的外周血和脾脏CD4⁺CD25⁺/CD4⁺、CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺/CD4⁺、CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺/CD4⁺CD25⁺细胞比例与其他各组比较差异均有统计学意义。实验重复3次

2．正常组、AA中药小剂量组、AA中药中剂量组、AA中药大剂量组脾脏CD4⁺CD25⁺ Treg细胞中p-Stat3相对表达水平分别为1.43±0.38、1.58±0.40、1.71±0.48、1.69±0.40，均低于AA组的2.17±0.53；正常组、AA中药小剂量组、AA中药中剂量组、AA中药大剂量组脾脏CD4⁺CD25⁺Treg细胞中Stat3相对表达水平分别为2.17±0.38、2.13±0.48、2.05±0.48、2.25±0.49，均高于AA组的1.69±0.36(P值均<0.05)(图1)。

图1. Western blot方法检测各组小鼠脾脏CD4⁺CD25⁺调节性T细胞磷酸化(p-Stat3)、Stat3、p-Akt、Akt蛋白表达水平.

1：正常组；2：AA组；3：AA中药小剂量组；4：AA中药中剂量组；5：AA中药大剂量组

3．正常组、AA中药小剂量组脾脏CD4⁺CD25⁺Treg细胞中p-Akt相对表达水平分别为1.26±0.39、1.47±0.48，均低于AA组的1.71±0.47；正常组、AA中药小剂量组脾脏CD4⁺ CD25⁺ Treg细胞中Akt相对表达水平分别为0.60±0.56、0.72±0.58，均高于AA组的0.44±0.37(P值均<0.05)(图1)。

4．AA中药中剂量组、AA中药大剂量组p-Akt相对表达水平分别为1.78±0.55、1.77±0.55，与AA组的1.71±0.47比较差异无统计学意义；AA中药中剂量组、AA中药大剂量组Akt相对表达水平分别为0.71±0.55、0.65±0.55，与AA组的0.44±0.37比较差异均无统计学意义(P值均>0.05)(图1)。

讨论

CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺ Treg细胞是一类表达CD4、CD25及转录因子Foxp3的T淋巴细胞亚型，占CD4⁺ T细胞的5%~10%。从正常组织中剔除CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺ Treg细胞会导致相关自身免疫病的发生，重新输注后可恢复[9]–[11]。Foxp3是CD4⁺CD25⁺ Treg细胞发挥免疫调节作用的关键因子，其对CD4⁺CD25⁺ Treg细胞的发育成熟和功能的完善发挥了重要作用[12]–[13]。由于绝大多数AA患者体内Treg细胞数量减少[14]，且相关的细胞因子分泌失衡，导致其自身免疫反应的抑制作用减弱，体内自身反应性T细胞的大量增殖活化，靶向性杀伤造血干细胞，引起骨髓造血功能衰竭。因此，CD4⁺ CD25⁺ Treg细胞的数量减少、功能异常及Foxp3的表达异常与AA的发病有关[3]。

Akt是原癌基因c-Akt表达编码的一种丝氨酸苏氨酸蛋白激酶，为PI3K下游的靶蛋白，是PI3K/Akt信号转导通路的核心，Akt使第308位上的苏氨酸位点(Thr308)和第473位上的丝氨酸(Ser473)磷酸化而被激活成为具有磷酸激酶活性的p-Akt，发挥抑制细胞凋亡、促进细胞增殖和促进细胞运动等生物学作用[15]。哺乳动物的雷帕霉素靶(mTOR)为Akt的下游靶蛋白，是PI3K/Akt信号转导通路的关键因子，在细胞的增殖、分化中起着中心调控点作用[16]。抑制PI3K-Akt-mTOR信号通路可增强CD4⁺CD25⁺ Treg细胞特异性基因Foxp3的表达[5]。信号转导子及转录激活子3 (Stat3)是Stat家族的重要成员，参与多种生理过程的调控，在JAK-Stats信号转导途径中发挥作用，经JAK磷酸化，成为其活性形式p-Stat3 (Tyr705)，促进下游多种靶基因的表达[17]。Wahl[18]研究发现，体内初始CD4⁺ T细胞在TGF-β因子的诱导及IL-6的协同作用下，通过激活Stat3以诱导RORγt的表达，抑制了以Foxp3表达为特征的Treg细胞分化。研究还发现，抑制磷酸化STAT3-RORγt通路，可以增强Foxp3的表达[19]。由此可以推断，下调Stat3磷酸化水平可以增强CD4⁺CD25⁺ Treg细胞中Foxp3的表达，而上调Stat3可以抑制该细胞内Foxp3的表达。此外，研究证实mTOR作为Akt的下游靶蛋白，可直接磷酸化Stat3丝氨酸位点(Ser727)，促进Stat3对靶基因的转录，而且Stat3依赖性转录对mTOR的作用相当敏感[20]。由此可以推断，上调p-Akt可以促进p-Stat3的表达。

本实验中AA中药三个不同剂量组的小鼠外周血及脾脏中CD4⁺CD25⁺ Treg的数量及Foxp3的表达高于AA组，说明鹿龙再生汤能提高AA模型小鼠CD4⁺CD25⁺ Treg的数量并促进Foxp3的表达，具有一定的免疫调节作用。AA模型小鼠CD4⁺CD25⁺ Treg细胞中Akt及Stat3表达较正常小鼠下降，p-Akt及p-Stat3的表达升高，Foxp3的表达下降。这与Sauer等[5]报道的激活PI3K-Akt-mTOR通路可以抑制Foxp3的表达及Wahl发现的激活Stat3抑制了以Foxp3表达观点一致。根据上述实验结果推断，小剂量的鹿龙再生汤能抑制该细胞中Akt及Stat3的磷酸化水平，上调SAA小鼠CD4⁺ CD25⁺ Treg细胞中Foxp3的表达，从而发挥一定的免疫调节作用。然而，中剂量及大剂量组CD4⁺CD25⁺Treg细胞内p-Akt的表达升高，Akt表达下降，而Foxp3的表达却升高，这似乎与文献报道不符。推测可能与CD4⁺CD25⁺ Treg细胞中Stat3的激活有关，AA中药中剂量及大剂量组CD4⁺CD25⁺ Treg细胞内p-Stat3的表达水平低于AA组，Stat3的表达水平高于AA组。较AA组而言，这两组小鼠脾脏CD4⁺CD25⁺ Treg细胞内Stat3的激活受抑制，Foxp3的表达自然增加，说明这两组中该细胞内Akt磷酸化引发的Foxp3的表达减弱的作用与Stat3的磷酸化受抑制引发的Foxp3的表达增加相比较，后者作用更强。此外，研究证实，p-Akt可以上调p-Stat3的表达，这也可以解释AA中药大剂量及AA中剂量组CD4⁺CD25⁺ Treg细胞内p-Stat3的表达水平略高于AA中药小剂量组的现象。本研究为中药鹿龙再生汤治疗AA提供一定的理论依据。

Funding Statement

基金项目：国家自然科学基金（81070400）；江苏省医学创新团队与领军人才项目（LJ201136）；江苏省中医药局科技项目（LZ11096）；南通市社会事业科技创新与示范计划（HS2013067）