Abstract
目的
观察输注纯化供者CD34+细胞治疗单倍型造血干细胞移植后移植物功能不良的疗效和安全性。
方法
对2014年1月至2018年3月期间接受供者纯化CD34+细胞治疗的12例单倍型造血干细胞移植后移植物功能不良患者进行回顾性分析。
结果
12例患者中男9例、女3例，中位年龄26（14~54）岁；急性淋巴细胞白血病4例，急性髓系白血病5例，慢性髓性白血病2例，慢性粒-单核细胞白血病1例。分选产物CD34+细胞纯度为92.0%（44.0%~97.0%），回收率为55.0%（45.0%~96.7%），回输CD34+细胞的中位数为1.9（0.9~4.4）×106/kg，CD3+细胞中位数为0.6（0.3~2.0）×104/kg。中性粒细胞恢复中位时间为18（14~39）d，血小板恢复中位时间为29（16~153）d，红细胞恢复中位时间为60（9~124）d。12例患者输注过程中未发生严重不良反应，10例获得完全缓解，1例患者获得部分缓解，1例患者无效，未发生重症感染和重度GVHD。
结论
回输供者纯化CD34+细胞是单倍型造血干细胞移植后植入功能不良的一种安全、有效治疗方法。
Keywords: CD34+细胞, 移植物功能不良, 异基因造血干细胞移植, 移植物抗宿主病
Abstract
Objective
To evaluate the efficacy and safety of purified CD34+ stem cell boost in the treatment of poor graft function (PGF) after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (HSCT).
Methods
12 patients with poor graft function, reported in our hospital during January 2014 to March 2018, were retrospectively analyzed; The donors of 12 patients were HLA mismatched family members, and all treated with donor purified CD34+ stem cell after G-CSF mobilization, calculating and statistical analyzing the purity of separation and the recovery rate of CD34+ stem cells. The related complications and the recovery of blood cells after infusion were observed.
Results
The purity of CD34+ cells in the separation products was 92.0% (44.0%–97.0%), and the recovery rate was 55.0% (45.0%–96.7%). The median number of CD34+ cells was 1.9 (0.9–4.4)×106/kg with CD3+ cells as 0.6 (0.3–2.0)×104/kg. The median durations of white blood cells, platelet and red blood cells recoveries were 18 (14–39), 29 (16–153) and 60 (9–124) days, respectively. All 12 patients didn't experience serious adverse reactions in the process of infusion, 10 patients achieved hematopoietic recovery, 1 case partial remission, 1 case no recovery, without occurrence of aggravated infection, graft versus host disease and other complications.
Conclusion
The infusion of donor purified CD34+ stem cell was a safe and effective method for PGF after allogeneic HSCT.
Keywords: CD34+-selected stem cell, Poor graft function, Allogeneic stem cell transplants, Graft-versus-host disease
移植物功能不良是异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）的严重并发症之一，发生率为5%~27%[1]–[2]。以往研究显示，移植物功能不良的高危因素包括供者类型、HLA相合程度、ABO血型不合、输注细胞数量、预处理方案的强度、移植物抗宿主病（GVHD）、病毒感染、骨髓抑制药物的应用等[3]–[4]。移植物功能不良的治疗方法包括二次移植、供者骨髓或外周干细胞输注、生长因子（红细胞生成素和血小板生成素）以及纯化CD34+细胞输注[5]。采用二次移植和直接输注未分选的造血干细胞会导致较高的GVHD发生率和治疗相关死亡率[6]–[7]，移植后长期应用细胞因子的疗效和安全性尚待明确[8]–[9]。CD34+细胞是理想的造血干/祖细胞移植物，可以重建髓系和淋系造血干细胞以及大量造血祖细胞，而且纯化的CD34+细胞轻松实现T细胞的体外去除，有效减少严重GVHD的发生。近年来，我们采用纯化供者CD34+造血干/祖细胞治疗12例移植物功能不良患者，报告如下。
病例与方法
1．临床资料：本研究对我院2014年1月至2018年3月期间12例接受供者纯化CD34 +细胞治疗的单倍型造血干细胞移植（haplo-HSCT）后移植物功能不良患者进行回顾性分析。纳入标准：移植物功能不良均为移植后获得造血重建后发生，疾病复发状态或嵌合率<90%以及合并严重感染的患者除外。12例患者中男9例、女3例，中位年龄26（14~54）岁；原发病：急性淋巴细胞白血病4例，急性髓系白血病5例，慢性髓性白血病2例，慢性粒-单核细胞白血病1例。移植前疾病状态：完全缓解（CR）2例，未缓解（NR）10例；输注纯化CD34+细胞前患者中位WBC为1.7（0.9~2.9）×109/L，中位PLT为16（6~25）×109/L，中位HGB为73（60~80）g/L。
移植物功能不良的定义参照文献[3]：移植后至少两系或三系细胞减少持续2周伴骨髓增生低下（ANC<0.5×109/L，PLT<30×109/L或血小板或红细胞输注依赖），嵌合率完全供者型，排除复发、严重GVHD、感染以及药物相关的骨髓抑制。12例患者的临床资料见表1。
表1. 12例接受供者纯化CD34 +细胞治疗单倍型造血干细胞移植后移植物功能不良患者的一般资料.
| 例号 | 性别 | 年龄（岁） | 诊断 | 移植前疾病状态 | 高危因素 | 嵌合率(%) | 累及细胞系 |
| 1 | 男 | 54 | AML-M5 | NR | 病毒感染，GVHD | 100 | P+R |
| 2 | 男 | 14 | T-ALL | CR | 输注CD34+细胞数低 | 100 | N+P+R |
| 3 | 女 | 15 | AML | NR | CMV,GVHD | 100 | N+P+R |
| 4 | 女 | 33 | AML-M2 | NR | CMV,GVHD | 100 | N+P+R |
| 5 | 男 | 18 | B-ALL | NR | 主要ABO血型不相容，GVHD | 100 | N+P+R |
| 6 | 男 | 44 | CMML | PR | 输注CD34+细胞计数低 | 100 | P+R |
| 7 | 男 | 17 | T-ALL | NR | CMV,GVHD | 100 | N+P+R |
| 8 | 男 | 43 | CML急变期 | NR | CMV,EBV,输注CD34+细胞数低 | 100 | N+P+R |
| 9 | 男 | 21 | CML加速期 | NR | CMV,EBV,输注CD34+细胞数低 | 100 | N+P+R |
| 10 | 女 | 14 | AML-M4 | CR | CMV,主要ABO血型不相容 | 100 | N+P+R |
| 11 | 男 | 28 | AML-M5 | NR | CMV,GVHD | 100 | N+P+R |
| 12 | 男 | 26 | T-ALL | NR | GVHD | 100 | N+P+R |
注：AML：急性髓系白血病；ALL：急性淋巴细胞白血病；T-ALL：急性T淋巴细胞白血病；CML：慢性髓性白血病；CMML：慢性粒-单核细胞白血病。CR：完全缓解；PR：部分缓解；NR：未缓解。CMV：巨细胞病毒；EBV：EB病毒；GVHD：移植物抗宿主病。N：中性粒细胞；P：血小板；R：红细胞
本研究经航天中心医院生物医学伦理委员会批准（20160420-XYZZ-01），全部患者及其供者均知情同意。
2．疗效评价标准：原发性植入不良：发生于移植后28 d内；继发性植入不良：发生于移植后血细胞恢复后。中性粒细胞恢复：ANC>0.5×109/L持续7 d；血小板恢复：PLT>50×109/L持续7 d；红细胞恢复：HGB>90 g/L且脱离红细胞输注。完全缓解：三系均获得改善；部分缓解：血小板和（或）中性粒细胞恢复但未脱离红细胞输注；无效：输注CD34+细胞后三系均未获得改善。CD34+细胞回收率（%）=分选后CD34+细胞数/动员后采集的CD34+细胞数×100%。
3．供者造血干细胞的采集及分选：使用粒细胞集落刺激因子（G-CSF）5~10 µg·kg−1·d−1进行供者外周血造血干细胞动员，第5天采集供者外周血干细胞。采集的有核细胞总数为（4~6）×1010。应用CliniMACS Plus系统（德国Miltenyi Biotec公司产品）对采集的造血干细胞进行CD34+细胞分选，流式细胞术测定CD34+细胞和CD3+细胞数。
4．CD34+细胞输注：纯化的CD34+细胞输注前储存于4 °C冰箱，在分选后24 h内输注，输注前计算纯度及CD3+细胞数。输注前应用环孢素A、他克莫司等免疫抑制剂，不需要进行其他预处理。输注后可继续给予生长因子及输血支持治疗。
5．GVHD的评估：急性GVHD和慢性GVHD的诊断和分级参照文献[10]–[11]。急性GVHD的随访时间为输注后100 d，慢性GVHD的随访时间为输注后1年。
6．随访：所有患者通过门诊或电话进行随访，随访截止日期为2018年1月。总生存（OS）时间：输注纯化供者CD34+细胞到随访截止或死亡的时间；无复发生存（RFS）时间：输注CD34+细胞到疾病复发或随访截止的时间。
7．统计学处理：采用SPSS 20.0进行统计学处理。计量资料用均数±标准差或中位数表示。GVHD的发生率、RFS率和OS率采用Kaplan-Meier曲线分析并描述。P<0.05为差异有统计学意义。
结果
1．纯化CD34+细胞的回收率：G-CSF动员后采集的有核细胞中位数为9.3（7.0~13.5）×108/kg，CD34+细胞中位数为3.4（1.3~6.0）×106/kg。CliniMACS系统分选后CD34+细胞中位数为1.9（0.9~4.4）×106/kg，CD3+细胞中位数为0.6（0.3~2.0）×104/kg，CD34+细胞纯度为92.0%（44.0%~97.0%），回收率为55.0%（45.0%~96.7%），详见表2。
表2. 12例单倍型造血干细胞移植后移植物功能不良患者纯化供者CD34+细胞输注情况.
| 例号 | 分选前CD34+细胞(×106/kg) | 分选后CD34+细胞(×106/kg) | CD34+细胞纯度(%) | CD34+细胞回收率(%) | 分选后CD3+细胞(×104/kg) |
| 1 | 3.2 | 2.9 | 90.0 | 90.6 | 1.0 |
| 2 | 3.4 | 2.7 | 85.0 | 80.0 | 0.4 |
| 3 | 2.4 | 1.4 | 93.8 | 58.3 | 1.2 |
| 4 | 3.9 | 2.1 | 97.0 | 54.1 | 0.2 |
| 5 | 4.5 | 4.4 | 95.0 | 96.7 | 0.6 |
| 6 | 2.8 | 1.3 | 93.0 | 45.8 | 1.0 |
| 7 | 3.3 | 1.5 | 95.0 | 45.0 | 1.1 |
| 8 | 3.4 | 1.7 | 96.0 | 50.0 | 0.3 |
| 9 | 1.3 | 0.9 | 92.0 | 76.0 | 0.5 |
| 10 | 5.8 | 3.2 | 89.0 | 55.0 | 0.3 |
| 11 | 6.0 | 3.3 | 77.0 | 55.0 | 0.4 |
| 12 | 1.5 | 1.1 | 44.0 | 73.0 | 2.0 |
2．疗效及不良反应：12例患者中10例完全缓解，1例患者获得部分缓解，1例患者无效。全部12例患者回输纯化供者CD34+细胞后白细胞恢复的中位时间为18（14~39）d，血小板恢复的中位时间为29（16~153）d，红细胞恢复的中位时间为60（9~124）d，回输后1、2、3个月检测嵌合率均为100%供者型。12例患者输注过程中未发生严重不良反应。
3．GVHD发生情况及生存：12例患者回输纯化供者CD34+细胞后，1例患者发生Ⅱ度急性GVHD，给予糖皮质激素、巴利昔单抗治疗有效；3例患者发生慢性GVHD，1例激素治疗有效，其他2例患者给予联合抗GVHD治疗效果不佳。至随访截止，12例患者中8例存活，4例死亡，死亡原因：复发1例，感染2例，慢性GVHD 1例，死亡时间分别为回输后的3（例1）、6（例3）、4（例5）和2个月（例8）。1年OS率为（62.9±14.9）%。详见表3。
表3. 纯化供者CD34+细胞输注治疗12例单倍型造血干细胞移植后移植物功能不良患者的疗效、GVHD发生情况及转归.
| 例号 | 疗效 | 中性粒细胞恢复时间(d) | 血小板恢复时间(d) | 红细胞恢复时间(d) | 急性GVHD | 慢性GVHD | OS时间（月） |
| 1 | CR | / | 22 | 60 | 无 | 无 | 3 |
| 2 | CR | 9 | 16 | 11 | 无 | 无 | 15 |
| 3 | CR | 39 | 26 | 47 | 无 | 无 | 6 |
| 4 | CR | 18 | 24 | 90 | 无 | 无 | 11 |
| 5 | CR | 23 | 54 | 16 | 无 | 广泛型 | 4 |
| 6 | CR | / | 68 | 60 | 无 | 无 | 22 |
| 7 | CR | 27 | 30 | 124 | 无 | 局限型 | 21 |
| 8 | NR | / | / | / | 无 | 局限型 | 2 |
| 9 | CR | 10 | 73 | 117 | 无 | 无 | 33 |
| 10 | CR | 14 | 14 | 88 | 无 | 无 | 8 |
| 11 | PR | 13 | 153 | − | Ⅱ度 | 无 | 4 |
| 12 | CR | 20 | 7 | 9 | 无 | 无 | 2 |
注：CR：完全缓解；PR：部分缓解；NR：治疗无效；/：不适用；OS：总生存
讨论
allo-HSCT后合并移植物功能不良可导致感染和出血性并发症发生率增高，严重影响患者的生存。本研究12例患者均为继发性移植物功能不良，嵌合率为100%供者型，进行纯化供者CD34+细胞回输前患者均未进行预处理，给予常规免疫抑制剂预防，10例患者获得完全缓解，1例患者部分缓解，1例患者无效。我们认为患者获得缓解主要与所有患者均是100%供者嵌合有关，而且回输的CD3+细胞数量极低，均在2×104/kg以下。因此患者回输纯化CD34+细胞均能耐受，轻松实现T细胞的体外去除，无治疗相关死亡，而且未发生Ⅲ/Ⅳ度急性GVHD。
国际上报道纯化CD34+细胞治疗移植物功能不良的疗效的文献比较多。近期Haen等[12]报道20例患者中，纯化CD34+细胞输注治疗移植物功能不良可达到80%的有效率，急性、慢性GVHD的发生率分别为18%、14%。和文献报道相似，本组病例的有效率为91.7%（11/12），急性、慢性GVHD的发生率分别为8.3%（1/12）、25.0%（3/12）。为避免冻存的造血干细胞数量不足，本组病例均采用G-CSF动员的外周血造血干细胞，采集的有核细胞中位数为9.3（7.0~13.5）×108/kg，CD34+细胞中位数为3.4（1.3~6.0）×106/kg。本组12例患者中性粒细胞细胞恢复的中位时间为18（14~39）d，血小板恢复中位时间为29（16~153）d，红细胞恢复中位时间为60（9~124）d，与文献[13]结果相似。回输纯化CD34+细胞的中位数为1.9（0.9~4.4）×106/kg，纯度为92.0%（44.0%~97.0%），其中1例患者（例12）分选前CD34+细胞计数只有1.5×106/kg，分选后的纯度仅为44%，担心纯度不够影响患者的疗效，我们对分选产物的细胞成分进行分析，计算CD3+细胞的计数为2×104/kg，考虑该患者移植前未缓解，仍按计划回输，结果在回输后第20天白细胞和血小板计数明显升高，而且无GVHD发生。
Ghobadi等[5]报道在造血干细胞动员时加入普乐沙福（Plerixafor）可明显提高CD34+细胞的数量，降低移植物功能不良的发生率。但亦有研究显示纯化CD34+细胞数量与治疗移植物功能不良的疗效无直接关系[13]–[14]，需要在以后的研究中进一步证实。
Liu等[15]报道间充质干细胞输注也可治疗移植后原发和继发移植物功能不良，而且与输注纯化CD34+细胞相比，不需要采集供者的造血干细胞。该研究报道20例移植物功能不良患者，采用第三方间充质干细胞回输，17例患者获得造血恢复，但13例患者发生感染，其中7例患者为EB病毒感染，有3例患者发生EB病毒相关移植后淋巴细胞增殖性疾病。
本研究结果初步表明，供者纯化CD34+细胞输注是治疗单倍型造血干细胞移植后移植物功能不良的一种有效办法。
References
- 1.Kong Y, Chang YJ, Wang YZ, et al. Association of an impaired bone marrow microenvironment with secondary poor graft function after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation[J] Biol Blood Marrow Transplant. 2013;19(10):1465–1473. doi: 10.1016/j.bbmt.2013.07.014. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 2.Olsson R, Remberger M, Schaffer M, et al. Graft failure in the modern era of allogeneic hematopoietic SCT[J] Bone Marrow Transplant. 2013;48(4):537–543. doi: 10.1038/bmt.2012.239. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 3.Dominietto A, Raiola AM, van Lint MT, et al. Factors influencing haematological recovery after allogeneic haemopoietic stem cell transplants: graft-versus-host disease, donor type, cytomegalovirus infections and cell dose[J] Br J Haematol. 2001;112(1):219–227. doi: 10.1046/j.1365-2141.2001.02468.x. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 4.Remberger M, Watz E, Ringdén O, et al. Major ABO blood group mismatch increases the risk for graft failure after unrelated donor hematopoietic stem cell transplantation[J] Biol Blood Marrow Transplant. 2007;13(6):675–682. doi: 10.1016/j.bbmt.2007.01.084. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 5.Ghobadi A, Fiala MA, Ramsingh G, et al. Fresh or cryopreserved CD34+-selected mobilized peripheral blood stem and progenitor cells for the treatment of poor graft function after allogeneic hematopoietic cell transplantation[J] Biol Blood Marrow Transplant. 2017;23(7):1072–1077. doi: 10.1016/j.bbmt.2017.03.019. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 6.Guardiola P, Kuentz M, Garban F, et al. Second early allogeneic stem cell transplantations for graft failure in acute leukaemia, chronic myeloid leukaemia and aplastic anaemia. French Society of Bone Marrow Transplantation[J] Br J Haematol. 2000;111(1):292–302. doi: 10.1111/j.1365-2141.2000.02306.x. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 7.Jabbour E, Rondon G, Anderlini P, et al. Treatment of donor graft failure with nonmyeloablative conditioning of fludarabine, antithymocyte globulin and a second allogeneic hematopoietic transplantation[J] Bone Marrow Transplant. 2007;40(5):431–435. doi: 10.1038/sj.bmt.1705760. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 8.Gaya A, Urbano-Ispizua A, Fernández-Avilés F, et al. Anemia associated with impaired erythropoietin secretion after allogeneic stem cell transplantation: incidence, risk factors, and response to treatment[J] Biol Blood Marrow Transplant. 2008;14(8):880–887. doi: 10.1016/j.bbmt.2008.05.008. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 9.Tanaka T, Inamoto Y, Yamashita T, et al. Eltrombopag for Treatment of Thrombocytopenia after Allogeneic Hematopoietic Cell Transplantation[J] Biol Blood Marrow Transplant. 2016;22(5):919–924. doi: 10.1016/j.bbmt.2016.01.018. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 10.Glucksberg H, Storb R, Fefer A, et al. Clinical manifestations of graft-versus-host disease in human recipients of marrow from HL-A-matched sibling donors[J] Transplantation. 1974;18(4):295–304. doi: 10.1097/00007890-197410000-00001. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 11.Sullivan KM, Shulman HM, Storb R, et al. Chronic graft-versus-host disease in 52 patients: adverse natural course and successful treatment with combination immunosuppression[J] Blood. 1981;57(2):267–276. [PubMed] [Google Scholar]
- 12.Haen SP, Schumm M, Faul C, et al. Poor graft function can be durably and safely improved by CD34+-selected stem cell boosts after allogeneic unrelated matched or mismatched hematopoietic cell transplantation[J] J Cancer Res Clin Oncol. 2015;141(12):2241–2251. doi: 10.1007/s00432-015-2027-x. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 13.Klyuchnikov E, El-Cheikh J, Sputtek A, et al. CD34(+)-selected stem cell boost without further conditioning for poor graft function after allogeneic stem cell transplantation in patients with hematological malignancies[J] Biol Blood Marrow Transplant. 2014;20(3):382–386. doi: 10.1016/j.bbmt.2013.11.034. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 14.Stasia A, Ghiso A, Galaverna F, et al. CD34 selected cells for the treatment of poor graft function after allogeneic stem cell transplantation[J] Biol Blood Marrow Transplant. 2014;20(9):1440–1443. doi: 10.1016/j.bbmt.2014.05.01. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 15.Liu X, Wu M, Peng Y, et al. Improvement in poor graft function after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation upon administration of mesenchymal stem cells from third-party donors: a pilot prospective study[J] Cell Transplant. 2014;23(9):1087–1098. doi: 10.3727/096368912X661319. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]