铁是血红蛋白与红细胞的重要组成部分，在机体氧运输、DNA合成和细胞代谢中发挥重要作用[1]–[2]。但是，多种因素可导致机体铁沉积量过多，造成机体铁过载，对心脏、骨髓、垂体等多脏器造成不同程度的损伤[3]–[4]。前期我们的研究已经证实铁过载可通过升高活性氧物质（ROS）损伤骨髓造血功能，影响造血干细胞及间充质细胞的数量和功能[5]–[7]。
由于免疫因素的介入会加剧铁过载的危害，近年来铁过载和机体免疫力的关系受到越来越多的关注[8]–[9]。T淋巴细胞是机体的免疫系统至关重要的免疫细胞，根据表面分子表达不同又可分为CD4+和CD8+ T淋巴细胞。CD4+ T淋巴细胞接受抗原刺激后可分化为辅助性T细胞（Th细胞）以及调节性T细胞（Treg），其自身可诱导CD8+ T淋巴细胞的成熟分化，而CD8+ T淋巴细胞又通过分化为细胞毒性T细胞（Tc细胞）参与机体免疫功能[10]。本研究中，我们通过小鼠铁过载模型进一步研究铁过载对小鼠免疫系统的影响。
对象与方法
1．研究对象：C57BL/6纯系雄性小鼠（体重19~20 g）购自中国科学院动物研究所，合格号为SCXK（京）2010–0014。所有小鼠均饲养于中国医学科学院放射研究所SPF级动物实验室。
2．主要试剂及仪器：右旋糖酐铁注射液购买于丹麦Pharmacosmos公司；N-乙酰半胱氨酸（NAC）、地拉罗司购自瑞士诺华公司；兔抗小鼠CD8-PE、CD8-perCP、CD3-APC、CD3-perCP、CD25-PE、FoxP3-APC、CD4-FITC、B220-APC、IFN-γ-FITC、IL-4-APC均购自美国eBioscience公司；钙黄绿素乙酰氧基甲酯（Calcein-AM）购自美国Sigma公司；活性氧检测试剂盒购自江苏碧云天生物技术有限公司；Annexin Ⅴ/碘化丙锭（PI）凋亡试剂盒购自美国BD公司；RPMI 1640购自美国Gibco公司；FACS Calibur™流式细胞仪为美国BD公司产品。
3．小鼠模型的建立：取40只小鼠随机分为4组，每组10只，分别设为铁过载组、祛铁组、抗氧化组及对照组。①铁过载组予25 mg/ml右旋糖酐铁腹腔注射，第1天起给药，3 d 1次，每次200 µl。②祛铁组予25 mg/ml右旋糖酐铁腹腔注射（第1天起给药，3 d 1次，每次200 µl）及地拉罗司灌胃（第2天起给药，3 d 2次，每次200 µl）。③抗氧化组予小鼠予25 mg/ml右旋糖酐铁腹腔注射（第1天起给药，3 d 1次，每次200 µl）及NAC灌胃（第2天起给药，3 d 1次，每次200 µl）。④对照组每3 d腹腔注射200 µl生理盐水。给药4周后处死小鼠，摘除眼球取外周血（肝素抗凝）并分离脾脏，用于后续实验。
4．外周血淋巴细胞可变铁池（LIP）水平检测：采用Calcein-AM标记小鼠淋巴细胞，由于细胞内存在的LIP可以淬灭荧光探针Calcein，因此应用Calcein的平均荧光强度（MFI）可反映小鼠淋巴细胞的LIP水平。参照文献[11]方法检测小鼠淋巴细胞的Calcein MFI。
5．ROS的测定：按试剂盒说明书进行操作。
6．流式细胞术检测小鼠外周血T淋巴细胞亚群及细胞凋亡：采用流式细胞术检测CD3 T淋巴细胞、B220淋巴细胞及Treg比例；检测CD4/CD8比值、Th1/Th2及Tc1/Tc2的比值；检测细胞凋亡率。按试剂盒说明书进行操作。
7．统计学处理：上述实验设2个复管，实验重复3次。所有资料用SPSS 20.0软件进行分析。两组比较采用完全随机设计资料的t检验，多组组间比较采用单因素方差分析，组内两两比较采用Newman Keuls检验。P<0.05为差异有统计学意义。
结果
1．小鼠模型的建立：与对照组相比，铁过载组小鼠淋巴细胞内Calcein荧光强度明显降低，提示铁过载组小鼠淋巴细胞内LIP含量明显增高（2 735.28±473.46对5 729.69±601.27，P<0.01），而祛铁组与铁过载组相比小鼠淋巴细胞内LIP含量明显减少（5 343.3±614.27对2 735.28±473.46，P< 0.01），而抗氧化组小鼠淋巴细胞内LIP含量仍高于对照组，提示铁过载组、祛铁组以及抗氧化组铁过载模型构建成功。
2．各组小鼠外周白细胞计数特征：与对照组相比，铁过载组小鼠外周血中性粒细胞比例明显上升（P<0.01），但绝对数与对照组相比无明显变化；与铁过载组相比抗氧化组中性粒细胞比例有所降低（P<0.05），与对照组相比差异无统计学意义。与对照组相比，铁过载组小鼠外周血淋巴细胞绝对数明显降低（P<0.05）以及比例均明显降低（P<0.05）（表1）。
表1. 各组小鼠外周血白细胞计数特征（n＝10，x±s）.
| 组别 | WBC（×106/ml） | ANC计数（×106/ml） | ALC计数（×106/ml） | ANC% | ALC% |
| 对照组 | 10.66±1.51 | 0.96±0.31 | 9.67±1.30 | 9.02±2.29 | 90.88±2.28 |
| 铁过载组 | 9.34±0.96 | 1.20±0.11 | 8.06±0.85a | 12.98±1.59a | 86.46±2.75a |
| 祛铁组 | 9.96±0.53 | 1.12±0.11 | 8.81±0.54 | 11.38±1.11 | 88.43±1.15 |
| 抗氧化组 | 10.50±0.83 | 1.07±0.08 | 8.99±0.50 | 10.41±0.80b | 89.47±0.83 |
注：ANC：中性粒细胞；ALC：淋巴细胞；与对照组相比，aP<0.05；与铁过载组相比，bP<0.05。实验设2个复管，实验重复3次
3．小鼠外周血细胞淋巴细胞比例：与对照组相比，铁过载组CD3＋T占淋巴细胞比例明显减少（P<0.01）而CD4/CD8比值明显升高（P<0.01）；与铁过载组相比，祛铁组CD3＋T细胞比例明显上升（P<0.01），且CD4/CD8比值明显降低（P< 0.01），抗氧化组与铁过载组相比CD3＋T细胞比例明显上升（P<0.01）及CD4/CD8比值明显下降（P<0.01）。祛铁组及抗氧化组与对照组相比，CD3＋T细胞比例仍有降低（P< 0.05）。B220+B细胞4组之间差异无统计学意义（表2）。
表2. 各组小鼠外周血CD3＋T、B220+ B淋巴细胞比例以及CD4/CD8比值变化（n=10，x±s）.
| 组别 | CD3+T淋巴细胞比例（%） | CD4/CD8比值 | B220+ B淋巴细胞比例（%） |
| 对照组 | 25.57±3.56 | 1.27±0.15 | 59.54±6.21 |
| 铁过载组 | 11.09±1.84a | 2.07±0.44a | 57.33±4.16 |
| 祛铁组 | 20.00±1.17ab | 1.43±0.27b | 57.98±2.29 |
| 抗氧化组 | 20.55±2.16ab | 1.09±0.16b | 57.72±3.64 |
注：与对照组相比，aP<0.01；与铁过载组相比，bP<0.01。实验设2个复管，实验重复3次
4．小鼠外周血中T淋巴细胞的分化情况：与对照组相比铁过载组小鼠外周血中Treg占CD4+ T细胞的比例明显上升（P<0.01），而祛铁组以及抗氧化组Treg比例与铁过载组相比显著下降（P<0.05），但祛铁组与对照组相比Treg比例仍有增加（P<0.01）。与对照组相比铁过载组小鼠外周血Th1/Th2比值显著下降（P<0.01），祛铁组以及抗氧化组Th1/Th2比值与铁过载组相比无明显改善。与对照组相比铁过载组小鼠外周血Tc1/Tc2比值显著下降（P<0.01），抗氧化组与铁过载组相比Tc1/Tc2比值明显升高（P<0.01），祛铁组Tc1/Tc2比值与铁过载相比无明显变化（表3）；但无论祛铁组以及抗氧化组与对照组相比Tc1/Tc2比值仍然降低（P<0.01）。
表3. 各组小鼠外周血T淋巴细胞的分化情况（n=10，x±s）.
| 组别 | Treg比例（%） | Th1/Th2比值 | Tc1/Tc2比值 |
| 对照组 | 6.28±1.04 | 1.06±0.49 | 1.17±0.12 |
| 铁过载组 | 10.09±0.82a | 0.41±0.05a | 0.34±0.11a |
| 祛铁组 | 7.25±0.62ab | 0.71±0.12 | 0.48±0.18a |
| 抗氧化组 | 8.95±0.56bc | 0.75±0.08 | 0.80±0.20abc |
注：Treg：调节性T细胞；Th：辅助性T细胞；Tc：细胞毒性T细胞；与对照组相比，aP<0.01；与铁过载组相比，bP<0.05；与祛铁组相比，cP<0.01。实验设2个复管，实验重复3次
5．小鼠外周血T淋巴细胞凋亡情况：用Annexin Ⅴ＋/PI＋代表凋亡细胞，实验提示：与对照组相比铁过载组小鼠外周血CD3＋CD8＋T淋巴细胞凋亡细胞比例显著上升[（7.37± 1.59）％对（19.85±1.44）%，P<0.01]，而祛铁组[（11.24±0.45）％对（19.85±1.44）%，P<0.01）]，以及抗氧化组[（11.86± 2.22）％对（19.85±1.44）%，P<0.01]与铁过载组相比凋亡比例明显下降，但与对照组相比祛铁组以及抗氧化组凋亡细胞所占比例仍增加（P<0.05）。祛铁组与抗氧化组相比，两组小鼠外周血CD3＋CD8＋T淋巴细胞凋亡细胞比例无明显变化。与对照组相比铁过载组小鼠外周血CD3＋CD8–T淋巴细胞凋亡细胞比例明显上升[（2.29±0.15）％对（5.06±0.38）%，P< 0.01]，而祛铁组[（3.21±0.35）％对（5.06±0.38）%，P<0.01]以及抗氧化组[（3.29±0.09）％对（5.06±0.38）%，P<0.01]与铁过载相比凋亡比例明显下降，但与对照组相比祛铁组以及抗氧化组凋亡细胞所占比例仍增加（P<0.05）。祛铁组与抗氧化组相比，两组小鼠外周血CD3＋CD8–T淋巴细胞凋亡细胞比例无明显变化。
6．小鼠外周血T细胞ROS：与对照组相比铁过载组小鼠外周血CD3＋T细胞的ROS MFI明显升高（168.32±10.27对140.48±6.11，P<0.01）；与铁过载组相比祛铁组（150.30±5.27对168.32±10.27，P<0.01）以及抗氧化组（145.25±2.50对168.32±10.27，P<0.01）小鼠CD3＋T细胞的ROS MFI明显降低。
讨论
近来研究提示，铁过载会导致机体免疫的紊乱，增加细菌和真菌的感染风险[11]–[12]，但具体影响以及作用机制仍不明确。本实验中我们利用构建的铁过载小鼠模型，并建立祛铁以及抗氧化小鼠模型，初步的探索小鼠铁超负荷对外周血淋巴细胞的作用及其机制。本组铁过载组小鼠外周血淋巴细胞内LIP明显上升提示小鼠铁过载模型成功建立，而祛铁组小鼠外周血淋巴细胞内LIP较铁过载组均有明显改善提示祛铁治疗有效。在此基础上，我们首先对外周血白细胞进行计数。结果提示铁过载小鼠外周血淋巴细胞绝对数以及比例明显下降，而中性粒细胞比例上升但绝对数无明显变化。该结果提示铁过载可能对淋巴细胞作用明显，于是我们进一步对小鼠外周血淋巴细胞亚群进行分析。结果显示铁过载组小鼠外周血中CD3+ T淋巴细胞的比例与对照组相比显著下降且CD4/CD8比值明显上升，而B220＋B淋巴细胞比例与对照组相比则无明显变化；而祛铁组较铁过载组CD3+ T淋巴细胞比例上升、CD4/CD8比值下降。提示铁过载可能对外周血T细胞影响更大，因此我们进一步分析了小鼠外周血中T淋巴细胞的分化情况。结果显示铁过载组小鼠外周血中Treg显著升高，Th1/Th2、Tc1/Tc2比值明显下降；祛铁组小鼠外周血中Treg相比铁过载组明显下降且与对照组差异无统计学意义，Th1/Th2比值较铁过载组明显上升，但Tc1/Tc2比值与铁过载组比较差异无统计学意义。提示铁过载可导致小鼠外周血中Treg细胞显著升高，而Treg细胞具有抑制异常或过度免疫应答的作用，Treg细胞表达上升可以发挥免疫负调控作用；铁过载引起外周血CD3＋CD8–T淋巴细胞向Th2细胞分化以及CD3＋CD8＋T淋巴细胞向Tc2细胞分化，引起外周血Th1/Th2以及Tc1/Tc2比值的失衡。最后我们检测了外周血T细胞亚群的凋亡情况，结果显示铁过载组小鼠无论CD3＋CD8–还是CD3＋CD8＋T淋巴细胞凋亡率均增加，祛铁组该诱导凋亡作用有所缓解。结果显示：①铁过载会引起外周血T淋巴细胞亚群不同程度的凋亡增加，导致外周血中CD3+ T淋巴细胞比例下降，CD4/CD8比值上升；②铁过载会引起Treg比例显著升高，导致CD3＋CD8–T淋巴细胞向Th2细胞分化以及CD3＋CD8＋T淋巴细胞向Tc2细胞分化。
在上述实验的基础上，我们初步探索铁过载对淋巴细胞作用的可能机制。ROS可通过NADPH氧化酶和线粒体电子传递链产生的。在正常情况下，低水平的ROS在氧化还原系统参与酶的活性调节。然而，过度的ROS积累可能会导致蛋白和基因氧化损伤，进一步导致细胞的衰老和凋亡[13]–[14]。已有研究显示ROS在T淋巴细胞的激活、活化、分化都起重要的调节作用[15]–[16]。我们用NAC向铁过载小鼠模型灌胃建立抗氧化组来抑制ROS，研究ROS在其中的发挥作用。实验结果提示在抗氧化组与铁过载组相比小鼠外周血淋巴细胞凋亡、分化都有不同程度的逆转。说明铁过载可能通过升高ROS来调节外周血免疫细胞。
本研究我们系统分析了铁过载对小鼠淋巴细胞数量及亚群比例的影响，祛铁治疗及抗氧化治疗可缓解这种影响。对铁过载的基础性研究有理论意义。
Funding Statement
基金项目：国家自然科学基金（81400092）；天津市自然科学基金（13JCYBJC23400）；天津市卫生局科技基金攻关项目（13KG106）；天津市卫计委重点项目（2015KR15）
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