沉默G蛋白偶联受体137基因对白血病K562细胞增殖的影响

慢性髓性白血病（CML）是一种起源于异常造血干细胞克隆的骨髓增殖性疾病，是常见的慢性白血病之一，可在各个年龄段发病，其特点是髓细胞的生产过剩[1]。尽管近年来各种治疗手段不断发展，但仅可以改善患者症状，不能根治本病，也不能阻断其发展，寻找有效抑制白血病的靶标则至关重要。

G蛋白偶联受体（GPR）是迄今为止最大的膜蛋白家族且参与信号传导。人类基因组中800多个基因参与编码该蛋白，占人类基因组总编码基因的2%[2]。GPR是一种整合膜蛋白，包括细胞外的N末端、7层跨膜α螺旋结构和细胞内C末端，GPR的激活可将细胞外信号传递至细胞内引起相应细胞反应[3]，对正常细胞及癌细胞的增殖监控具有重要作用。肿瘤细胞通过劫持GPR的正常生理功能而得以存活、增殖，进而逃脱免疫系统的监视，增加血管生成，侵袭周围组织或转移到其他器官[2]。GPR137也称为TM7SF1L1、C11orf4或GPR-137A，是一种包含417个氨基酸的膜蛋白家族，属于孤儿G蛋白偶联受体。GPR137在多种肿瘤细胞中高表达[4]–[11]，但在白血病中的作用未见报道。鉴于此，本研究构建沉默GPR137基因的慢病毒质粒Lv-shGPR137，探讨GPR137基因对白血病K562细胞增殖的影响。

材料与方法

1．质粒与细胞株：慢病毒质粒由武汉淅玛公司构建；293T包装细胞及慢病毒包装质粒系统由本实验室保存；人CML细胞株K562由中国医学科学院血液学研究所熊冬生教授馈赠。

2．主要试剂：DMEM培养基及RPMI 1640培养基购自美国Gibco公司；反转录及SYBR Green PCR试剂盒购自日本TaKaRa公司；GPR137抗体购于英国Abcam公司；碘化丙锭（PI）及CCK-8均为碧云天公司产品；甲基纤维素为美国Sigma公司产品。

3．细胞培养及分组：人胚肾293T细胞及人慢性髓性白血病细胞株K562细胞分别使用含10％胎牛血清DMEM培养基及RPMI 1640培养基培养，并加入100 U/ml青霉素和100 µg/ml链霉素，于37 °C、5% CO₂、饱和湿度条件下培养。将对数生长期细胞分为空白对照组（未转染组）、阴性对照组（转染无效序列组）和GPR137基因沉默组。

4．Lv-shGPR137慢病毒的包装及K562细胞的感染：对数生长期人胚肾细胞株293T细胞于转染前1 d更换为无血清无抗生素的培养基，细胞融合达70%~80％后，分别将各重组质粒按照lipofectamin™转染试剂盒（lifescience）说明共转染293T细胞。分别将7 µg目的基因载体、7 µg psPax2质粒、3 µg pRSV Rev质粒和3 µg VSV-G质粒与转染试剂按1∶2.5比例混匀，室温静止10 min，将混合好的转染试剂逐滴加入细胞，于37 °C、5% CO₂培养箱中培养，孵育4~6 h更换为常规新鲜培养基培养。48及72 h后观察细胞转染效率并收集病毒上清，采用高速离心法浓缩收集病毒上清。浓缩后的病毒分别感染各组K562细胞并进行后续实验。

5．实时PCR法检测K562细胞中Lv-shGPR137 mRNA的表达：K562细胞感染后5 d收集各组细胞，使用TRIzol提取细胞总RNA，取1 µg RNA逆转录为cDNA，按SYBR Green PCR试剂盒说明进行PCR扩增，扩增条件：95 °C变性3 min; 95 °C变性12 s、62 °C退火40 s，扩增40循环；最后65 °C延伸10 min收集SYBR Green荧光信号，生成熔解曲线以确定扩增产物的特异性。目的基因GPR137及内参GAPDH的引物序列如下：GPR137基因的上游引物为5′-CAACGG GAACTGTCAGCGA-3′；下游引物为5′-GGCATACAGGGTGGTGTAGG-3′；GAPDH基因的上游引物为5′-GGACACTGAGCAAGAGAGGC-3′；下游引物为5′-TTATGGGGGTCTGGGATGGA-3′。采用ABI7500检测获取各组Ct值，利用公式RQ=2^−ΔΔCt计算实验组目的基因相对于对照组的变化倍数来比较基因表达的差异。每组3个复孔，实验至少重复3次。

6．Western blot法检测GPR137基因在K562细胞的敲减水平：K562细胞感染5 d后收集细胞，PBS洗涤，加入RIPA细胞裂解液和蛋白酶抑制剂PMSF，充分混匀，冰上裂解30min。4 °C离心10 min(12 000×g），收集上清，用BCA蛋白浓度检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司产品）测定蛋白浓度。每个样品按照4∶1的比例加入5×上样缓冲液，煮沸5 min。取20 µg蛋白进行SDS-PAGE电泳分离，将蛋白转移到PVDF膜，50 g/L脱脂奶粉封闭1 h后，与Anti-GPR137兔多克隆抗体孵育（1∶1 000），4 °C过夜，PBS洗涤后与1∶3 000抗兔二抗（上海碧云天生物技术有限公司产品）孵育1 h，采用ECL显色，以Image Lab软件进行灰度分析。

7．CCK-8法检测沉默GPR137基因后K562细胞的活性：1×10⁴个K562细胞接种于96孔板，参照CCK-8试剂盒说明进行操作，K562细胞感染后第5天，每孔（实验孔：含细胞的培养基＋毒性物质；对照孔：含细胞的培养基；空白孔：不含细胞的培养基）加入10 µl的CCK-8继续孵育2 h，而后采用STAKMAX™酶标仪测定450 nm处的吸光度（A）值，实验重复3次。

$$细胞增殖率(\%)=\frac{A_{实验孔}-A_{空白孔}}{A_{对照孔}-A_{空白孔}}\times 100\%$$

8．集落形成实验检测沉默GPR137基因后K562细胞集落形成能力：接种感染后5 d的K562细胞于6孔板（500个/孔），加入含0.9％甲基纤维素的完全培养基2 ml，于37 °C、5% CO₂、饱和湿度条件下常规培养，第10天记录细胞集落形成数，大于50个细胞者为1个克隆集落。每组设3个复孔，实验重复3次。按以下公式计算集落形成率：

$$集落形成率(\%)=\frac{集落形成数}{接种细胞数}\times 100\%$$

9．流式细胞术检测沉默GPR137基因后K562细胞周期的变化：收集感染后5 d的K562细胞，调整细胞密度为1× 10⁶/ml，逐滴加入预冷的75％乙醇，4 °C固定细胞12 h，预冷PBS洗涤后，加入10 µl RnaseA去除样本RNA，25 µl PI 37 °C避光孵育1 h，上机检测各组细胞周期分布。

10．统计学处理：数据以x±s表示，采用SPSS17.0软件进行单因素方差分析，以P<0. 05为差异有统计学意义。

结果

1．重组慢病毒shGPR137对K562细胞的感染效率：本实验获得高滴度的重组慢病毒shGPR137（2×10⁸），K562细胞的感染效率为90%（图1），其感染K562细胞的感染复数（MOI）值为40。

图1. 光学显微镜（A）和荧光显微镜（B）下观察慢病毒shGPR137感染K562细胞的效率（×100）.

2．沉默GPR137基因对K562细胞中GPR137mRNA及蛋白的表达的影响：GPR137基因沉默组GPR137 mRNA的表达低于空白对照组和阴性对照组[（11.18±0.97）％对100%，P=0.001；（11.18±0.97）％对（97.99±3.71）%，P= 0.003]。GPR137基因沉默组中GPR137蛋白的表达量低于空白对照组和阴性对照组[（23.14±0.04）％对（81.60±0.55）%，P=0.008；（23.14±0.04）％对（80.37±0.17）%，P= 0.009]（图2）。

图2. 沉默GPR137基因对GPR137蛋白表达的影响.

1：空白对照组；2：阴性对照组；3：GPR137基因沉默组

3．沉默GPR137基因对K562细胞增殖的抑制作用：感染后第5天，GPR137基因沉默组细胞的增殖率[（60.89±2.89）%]低于空白对照组（100%）、阴性对照组[（90.27± 1.99）%]（P值均<0.05），提示沉默GPR137基因可抑制K562细胞的活性。

4．沉默GPR137基因对K562细胞集落形成的抑制作用：如图3所示，GPR137基因沉默组K562细胞集落形成[（10.60±0.40）%]少于空白对照组[（25.10±0.70）%]和阴性对照组[（24.40±0.40）%]（P=0.002，P=0.003）。空白对照组与阴性对照组之间差异无统计学意义（P=0.477）。提示沉默GPR137基因可显著抑制K562细胞的集落形成能力。

图3. 沉默GPR137基因对K562细胞集落形成的抑制作用.

5．流式细胞术检测沉默GPR137基因对K562细胞周期的影响：与阴性对照组比较，GPR137基因沉默组G₀/G₁期细胞比例增高（P=0.001），G₂/M期细胞比例减少（P=0.001），表明沉默GPR137基因可使K562细胞停滞在G₀/G₁期（表1）。

表1. 流式细胞术检测沉默GPR137基因对K562细胞周期的影响（％，x±s）.

组别	G0/G1期	S期	G2/M期
空白对照组	50.06±0.30	26.36±0.99	23.58±1.30
阴性对照组	50.33±0.01	25.65±2.16	24.02±2.15
GPR137基因沉默组	67.39±0.56a	22.61±0.55	10.00±0.01b

注：同空白对照组比较，^aP=0.001；与阴性对照组比较，^bP=0.001

讨论

GPR在多种器官或组织中高表达并影响肿瘤进展，其成员GPR137是一种新型孤儿G偶联蛋白受体，在中枢神经系统、胸腺、内分泌腺、肺癌等普遍表达[12]，诱导肿瘤发生发展过程，但其在白血病发生发展中的作用却未有研究。鉴于此，本课题主要探究GPR家族成员GPR137对白血病K562细胞的作用，通过敲减K562细胞中GPR137基因的表达，研究沉默GPR137基因对K562细胞生物学特性的影响，以揭示其作为白血病治疗靶标的理论基础。课题组成功建立了GPR137对白血病K562细胞作用的研究体系，Lv-shGPR137作用于K562细胞，可有效降低白血病K562细胞中GPR137mRNA及蛋白的表达，证明该研究体系可有效性进行后续GPR137基因在白血病K562细胞中的功能研究。采用该体系研究发现，敲减GPR137基因在白血病K562细胞中的表达，可抑制K562细胞增殖、降低细胞集落形成数目，并使细胞周期阻滞于G₀/G₁期。

GPR137在各种恶性胶质瘤细胞中普遍高表达，沉默GPR137基因可抑制胶质瘤细胞的增殖和集落形成能力，并阻滞胶质瘤细胞的周期进展[4]。对于消化系统肿瘤，GPR137可参与肝癌的发生发展过程[5]、抑制肝癌细胞的增殖、降低肝癌细胞集落形成能力、诱导细胞周期阻滞在G₀/G₁期及G₂/M期，沉默GPR137可促进肝癌细胞凋亡[6]；GPR137也可促进胃肠肿瘤的增殖，敲除GPR137基因可抑制胃癌细胞生长，降低胃癌细胞的增殖[7]、抑制结肠癌细胞的增殖和集落形成并阻滞细胞周期于G₀/G₁期[8]。此外，GPR137基因还参与膀胱癌[9]、胰腺癌[10]、髓母细胞瘤[11]等恶性肿瘤的发生发展。与上述研究类似，本研究通过慢病毒介导shRNA敲减K562细胞中GPR137基因的表达，发现K562细胞的增殖能力在GPR137基因沉默组明显降低，细胞集落形成实验进一步证明，敲减GPR137基因后K562细胞形成的集落体积小且数目减少。抑制GPR137基因的表达可有效降低K562细胞增殖及集落形成能力，该作用与GPR137基因调控细胞周期有关。沉默GPR137基因的K562细胞，其G₀/G₁期的细胞比例增加，说明GPR137基因可调控K562细胞的细胞周期，使其阻滞于G₀/G₁期，进而导致细胞增殖能力降低，从而抑制白血病K562细胞的恶性增殖。

目前已发现，GPR137与前列腺特异性气味孤儿受体（PSGR）高度同源，特异性气味孤儿（PSGR）在前列腺正常组织中限制性表达，可作为前列腺癌的诊断标志物[13]。GPR137也可作为发育不良型纤维鞘（DFS）[14]或乳腺癌治疗的分子靶点[15]。本研究初步证实GPR137基因可通过调控细胞周期促进K562细胞的增殖及集落形成，沉默该基因的表达可有效抑制白血病细胞K562的增殖，可能成为慢性白血病治疗的潜在靶点。

Funding Statement

基金项目：国家自然科学基金（81403263、81573772）；山东省科技发展计划（2014GSF118141）