O-GlcNAc糖基化对Nalm-6细胞生物学行为及依托泊苷诱导凋亡的影响

Abstract

Objective

To explore the effects of O-GlcNAc glycosylation and its key enzyme OGT on the biological behaviors and etoposide (Vp16) - induced apoptosis of Nalm-6 cells.

Methods

Low O-GlcNAc modified Nalm-6 cells model was established with Alloxan, an inhibitor of OGT. The influence of Alloxan on Nalm-6 cells proliferation was checked by CCK-8 assay, apoptosis and cell cycle by flow cytometry. Nalm-6 cells were treated with different concentrations of Vp16 for 12 h, and then the O-GlcNAc level and the expressions of OGT were examined by Western blot. After treating Nalm-6 with Alloxan for 24 h and then 5 µg/ml of Vp16 for 12 h, the apoptosis of different groups were measured with flow cytometry, and the expression of apoptosis-associated proteins Bax and Bcl-2 were examined by Western blot.

Results

With the concentration of Vp16 increasing, the O-GlcNAc modified levels of total protein and the expression of OGT were up regulated (P<0.05, n=6); Alloxan could slow down the proliferation capacity, induce apoptosis[(15.190±2.539) % vs (21.910±4.105) %, P=0.007], arrest cell cycle[G1 phase: (43.534±4.453) % vs (57.322±6.091) %, P=0.003; S phase: (50.747±5.937) % vs (37.201±4.661) %, P=0.001]. Alloxan could inhibit the apoptosis caused by Vp16[(75.195±13.845) % vs (52.741±10.815) %, P=0.011] along with Bax decreasing (5.496±1.998 vs 2.950±0.703, P=0.015) and Bcl-2 increasing (0.454±0.125 vs 0.803±0.223, P=0.013).

Conclusion

Changes of O-GlcNAc modified level of Nalm-6 cells along with the inhibition of OGT could influence the biological behaviors and inhibit apoptosis induced by Vp16.

O连接的N-乙酰葡萄糖胺（O-GlcNAc）糖基化是由Zachara和Hart首次发现的一种重要的蛋白质翻译后修饰[1]。O-GlcNAc糖基化是一个动态可逆的过程，由乙酰氨基葡萄糖转移酶（OGT）负责糖基化，N-乙酰氨基葡萄糖苷酶（OGA）负责去糖基化。在生物体内，O-GlcNAc糖基化控制基本的生命过程，例如蛋白质的合成、染色质的结构、DNA脱甲基化以及生物昼夜规律。AKT[2]等信号蛋白以及c-Myc[3]、p53[4]、NF-κB[5]等转录因子都存在O-GlcNAc糖基化修饰。近年来，大量研究证实O-GlcNAc糖基化蛋白在乳腺癌[6]、前列腺癌[7]、膀胱癌[8]等多种肿瘤中发挥重要作用，但并没有在急性B淋巴细胞白血病（B-ALL）以及其耐药方面中进行相关研究。本研究选用B-ALL细胞株Nalm-6细胞作为主要研究对象，从糖生物学角度分析O-GlcNAc糖基化及相关酶OGT在B-ALL发展及对依托泊苷（Vp16）诱导凋亡方面的作用，并初步探讨其作用机制。

材料与方法

1．主要试剂和仪器：胎牛血清（FBS）购自美国Gibco公司；RPMI 1640培养基购自美国Hyclone公司；CCK-8细胞增殖和细胞毒性检测试剂盒购自日本同仁公司；四氧嘧啶（Alloxan）、Vp16为江苏恒瑞医药公司产品；鼠源β-actin、Bax、兔源Bcl-2一抗均购于美国Proteintech公司；鼠源O-GlcNAc糖基化特异性抗体RL2、兔源OGT一抗购自美国Abcam公司；山羊抗兔二抗购自北京中杉金桥生物公司；细胞周期和凋亡检测试剂盒、AnnexinⅤ-FITC/碘化丙锭（PI）细胞凋亡试剂盒购自美国BD公司；Guava easy-Cyte8H流式细胞仪购自美国EMD Millipore公司；C-Digit化学发光仪购自美国LI-COR公司。

2．细胞培养：Nalm-6细胞株为山东大学齐鲁医院低温实验室保存，用含10%FBS的RPMI 1640培养基（含100 U/ml青霉素/链霉素），在37 °C、5% CO₂、饱和湿度条件下培养，2~3 d换液1次。取对数生长期细胞进行实验。

3． Western blot法检测OGT、O-GlcNAc糖基化及凋亡相关蛋白水平：将Nalm-6细胞接种于6孔板中，分别加入终浓度为0、5和10 mmol/L的Alloxan，作用24 h后收集细胞，PBS缓冲液洗2遍以去除残留的培养基，每个样品加入100 µl细胞裂解液提取总蛋白。BCA法测定蛋白浓度。取适量蛋白进行SDS-PAGE，转印至聚偏二氟乙烯膜（PVDF），室温于TBST缓冲液溶解的50 g/L脱脂奶粉中封闭1 h，用TBST缓冲液洗膜3次，加入RL2、OGT一抗后室温摇床孵育1 h，再置于4 °C冰箱中孵育过夜，用TBST缓冲液洗膜3次，于相应的二抗室温孵育1 h，TBST缓冲液洗膜3次，将膜置于C-Digit化学发光仪曝光显影。同法检测不同浓度的Vp16处理后O-GlcNAc水平变化以及Alloxan联合Vp16作用后凋亡相关基因Bax、Bcl-2在蛋白水平的变化。

4． CCK-8法检测细胞增殖：取对数生长期的Nalm-6细胞，分为Alloxan处理组和对照组，同时设置空白组（不加细胞）。将细胞种于96孔板中（每孔100 µl，细胞密度为5×10⁵/ml），每组设置3个复孔。Alloxan处理组加入Alloxan（终浓度10 mmol/L），分别于加药培养后0、1、2、3、4 d加入CCK-8检测试剂（每孔10 µl），在37 °C、5% CO₂、饱和湿度条件下培养2 h，肉眼观察染色情况，然后用酶标仪检测450 nm处吸光度（A）值。结果以相对吸光度值表示。

5．流式细胞术检测细胞周期：分为对照组和Alloxan处理组。将Nalm-6细胞接种于12孔板中（每孔1 ml，细胞密度为4×10⁵/ml），Alloxan处理组加入Alloxan（终浓度5 mmol/L），对照组加入等量无菌水，置于培养箱中继续培养24 h，收集细胞，用预冷的PBS缓冲液洗2遍，加入75%乙醇固定过夜，第2天用预冷的PBS缓冲液洗涤细胞，每个样本加入500 µl PI染色液，避光孵育15 min，上机检测细胞周期。

6．流式细胞术检测细胞凋亡：先向Nalm-6细胞中加入Alloxan（终浓度5 mmol/L），对照组加入等量无菌水，作用24 h后加入Vp16（终浓度5 µg/ml），12 h后收集各组细胞，倒置显微镜下进行细胞计数。每组取1×10⁶个细胞，用PBS洗2遍，300×g离心5 min后弃上清，用100 µl 1×AnnexinⅤ结合液重悬细胞，加入PI和FITC标记的AnnexinⅤ各5 µl，室温避光孵育20 min，再加入1×AnnexinⅤ结合液100 µl，混匀后上机检测。

7．统计学处理：应用SPSS 19.0进行数据分析，数据以x±s表示。用单因素方差分析进行多组间数据比较，用t检验进行两组间数据比较。P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1． Western blot检测Alloxan对Nalm-6细胞OGT表达及O-GlcNAc糖基化水平的影响：以不同浓度的Alloxan处理细胞24 h后，Nalm-6细胞OGT表达以及O-GlcNAc糖基化程度逐渐降低（P<0.05），并且有一定的剂量依赖性。Alloxan浓度为10 mmol/L时，O-GlcNAc降低最为明显，可以此浓度构建低O-GlcNAc细胞模型。详见图1。

图1. Western blot检测不同浓度四氧嘧啶（Alloxan）对Nalm-6细胞乙酰氨基葡萄糖转移酶（OGT）表达和O-GlcNAc糖基化的影响（P<0.05，n=6）.

2． Western blot检测Vp16对Nalm-6细胞OGT表达及O-GlcNAc糖基化水平的影响：随着Vp16浓度的增加，Nalm-6细胞内OGT表达量逐渐增加。在低浓度Vp16组，细胞总蛋白O-GlcNAc糖基化程度变化不明显，当Vp16浓度达到1 µg/ml时，O-GlcNAc糖基化程度明显增高（P<0.05，n=6）。详见图2。

图2. 依托泊苷（Vp16）对Nalm-6细胞乙酰氨基葡萄糖转移酶（OGT）表达和O-GlcNAc糖基化水平的影响（P<0.05，n=6）.

3． CCK-8法检测Alloxan对Nalm-6细胞增殖、凋亡影响：以10 mmol/L Alloxan作用于Nalm-6细胞后，连续4 d进行CCK-8法检测。结果表明，在Alloxan处理第1天时，细胞增殖已经受到明显抑制（P=0.022），随着药物作用时间延长，Alloxan仍能显著抑制细胞增殖（P<0.001）（表1）。以10 mmol/L Alloxan处理Nalm-6细胞24 h后，Alloxan组细胞的凋亡率为（21.910±4.105）%，而对照组（未处理）凋亡率仅为（15.190±2.539）%，差异有统计学意义（P=0.007）（图3）。

表1. CCK-8法检测四氧嘧啶（Alloxan）对Nalm-6细胞增殖的影响（相对吸光度值，x±s）.

组别	样本数	1d	2d	3d	4d
对照组	6	1.421±0.186	1.949±0.322	2.602±0.259	2.862±0.229
Alloxan组	6	1.179±0.114	1.236±0.116	1.880±0.233	2.023±0.297
t值		2.717	5.124	5.062	5.479
P值		0.022	<0.001	<0.001	<0.001

图3. 流式细胞术检测四氧嘧啶（Alloxan）对Nalm-6细胞凋亡的影响.

4．流式细胞术检测Alloxan对Nalm-6细胞周期的影响：10 mmol/L Alloxan处理Nalm-6细胞48 h后，对照组G₁期细胞比例为（43.534±4.453）%，S期细胞比例为（50.747±5.937）%；Alloxan处理组G₁期Nalm-6细胞比例高于未用Alloxan处理的对照组（t=3.827，P=0.003），S期细胞比例高于对照组（t=4.396，P=0.001），G₂期细胞比例两组差异无统计学意义（t=1.928，P=0.083），详见表2、图4。上述结果表明，Alloxan可将Nalm-6细胞周期阻滞于G₁期，减少进入S期的细胞比例。

表2. 四氧嘧啶（Alloxan）对Nalm-6细胞周期的影响（%，x±s）.

组别	样本数	细胞周期
		G1期	S期	G2期
对照组	6	43.534±4.453	50.747 ±5.937	5.361±0.728
Alloxan组	6	57.322±6.091	37.201±4.661	4.933±0.675
t值		3.827	4.396	1.928
P值		0.003	0.001	0.083

图4. 流式细胞术检测四氧嘧啶（Alloxan）对Nalm-6细胞周期的影响.

A：Alloxan组；B：对照组

4． Alloxan对Vp16诱导Nalm-6细胞凋亡的影响：10 mmol/L Alloxan处理后的Nalm-6细胞经5 µg/ml Vp16作用12 h，流式细胞术检测显示细胞凋亡率低于未处理组[（52.741±10.815）%对（75.195±13.845）%，t=3.146，P=0.011]（图5A），Western blot检测显示促凋亡蛋白Bax蛋白表达下调（5.496±1.998对2.950±0.703，t=2.944，P=0.015）、抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白表达上调（0.454±0.125对0.803±0.223，t=3.017，P=0.013）（图5B）。

图5. 四氧嘧啶（Alloxan）对依托泊苷（Vp16）诱导Nalm-6细胞凋亡的影响.

A：流式细胞术检测Alloxan作用前后Vp16所致Nalm-6细胞凋亡；B：Western blot检测Alloxan对Vp16诱导Nalm-6细胞Bcl-2、Bax蛋白表达的影响

讨论

细胞内能量代谢异常被认为是肿瘤细胞的典型特征[9]。O-GlcNAc糖基化修饰过程的糖基供体为UDP-GlcNAc，该化合物是己糖胺合成途径（HBP）的终产物，在生物体中约有3%~5%的葡萄糖进入HBP途径[10]。近年来研究证实，在多种实体肿瘤中都存在O-GlcNAc修饰以及关键酶的异常[11]。

早在2002年，Konrad等[12]就提出了Alloxan是OGT的特异性抑制剂。在后续研究中，该理论得到了Lee等[13]、Gurel等[14]研究结果的证实。Xu等[15]研究发现在高糖及氧化损伤的视网膜细胞存在蛋白的O-GlcNAc糖基化程度增高，在用Alloxan干预后其O-GlcNAc糖基化修饰水平下降，并且可减少高糖以及高氧环境对细胞的损伤。本研究采用Nalm-6细胞作为研究对象，证明了Alloxan能够降低细胞的O-GlcNAc修饰水平，可以用来构建低O-GlcNAc修饰的细胞模型。

Kim等[16]发现在宫颈癌细胞中存在O-GlcNAc修饰的异常，其中异常修饰的宿主细胞因子HCF-1可影响人乳头瘤病毒（HPV）的E6以及E7癌基因蛋白的表达并影响宫颈癌的发生发展；用siRNA干扰OGT表达可以明显降低E6以及E7蛋白的表达，细胞的增殖、侵袭、转移也被显著抑制。本研究应用OGT抑制剂Alloxan作用于Nalm-6细胞，证明Alloxan可以明显抑制Nalm-6细胞的增殖并诱发细胞凋亡。

Vp16是作用于细胞周期的特异性抗肿瘤药物，其作用靶点为DNA拓扑异构酶Ⅱ，影响DNA修复。本研究结果表明，Vp16作用于Nalm-6细胞可导致总蛋白O-GlcNAc修饰程度增加并伴随着OGT表达上调。那么Vp16为何会上调OGT表达？研究表明Vp16在杀伤细胞的同时可以影响细胞内的糖代谢。Demel等[17]曾研究发现Vp16可以增加糖代谢相关蛋白葡萄糖转运蛋白-1（Glut1）和已糖激酶2（HKII）的表达，并且，Ferrer等[18]证实OGT和Glut1的关系也非常密切，该文献中指出Glut1在OGT调控代谢方面有至关重要的作用，所以，笔者推测，当Vp16处理Nalm-6细胞后可能导致Glut1表达升高，进而导致糖代谢改变从而上调OGT的表达以及O-GlcNAc糖基化程度。

Stacey等[19]应用时差显微成像技术研究证明Vp16对处于S期到G₂期的细胞的杀伤作用是G₁期的2~3倍。可见，Vp16对细胞的杀伤作用与处于分裂期的细胞比例密切相关。近年来，研究证实抑制OGT的活性可以阻断cyclin D1蛋白的合成以及细胞增殖，并降低细胞周期相关蛋白PI3K和MAPK蛋白的表达。在本研究中，Alloxan抑制Nalm-6细胞OGT活性后，G₁期细胞比例增多，S期细胞比例减少，而更重要的是，Alloxan可明显减少Vp16所致的Nalm-6细胞凋亡，同时伴随着促凋亡蛋白Bax表达上调和抑凋亡蛋白Bcl-2表达下调，推测该现象可能与Alloxan改变细胞周期从而减少了Vp16药物有效作用的细胞比例并进一步调节凋亡相关蛋白Bax及Bcl-2相关。

Funding Statement

基金项目：山东省科技攻关计划（2014GSF118131）；深圳市科技研发资金知识创新计划（JCYJ2014041811544917）

Fund program: Shandong Provincial Technology R&D Project（2014GSF118131）; Shenzhen S&T Research Funding Innovation Project（JCYJ2014041811544917）