Abstract
目的
分析CD10阴性的前B急性淋巴细胞白血病（CD10−pre B-ALL）患者的临床特征和预后。
方法
对6例成人CD10− pre B-ALL患者的临床和实验室资料进行回顾性分析，结合文献复习明确该类型患者的临床特征及预后。
结果
CD10−pre B-ALL占ALL的1.5%（6/409），占B-ALL的1.8%（6/343），占pre B-ALL的11.5%（6/52）。6例患者均为男性，中位年龄为33.5岁，起病时中位WBC为101.78×109/L，所有患者均伴有MLL-AF4融合基因表达。5例患者经1个疗程诱导化疗即获得完全缓解（CR），1例患者经3个疗程化疗后才获得CR。2例患者在CR1期行异基因造血干细胞移植（allo-HSCT），1例患者CR后短期内即复发，在CR2期行allo-HSCT。1例患者正在等待移植。2例未移植患者1例复发死亡，1例尚处于缓解状态。
结论
CD10−pre B-ALL是一类具有独特临床特征的成人ALL亚型，发生率较低，常见于男性，起病时白细胞水平较高，MLL-AF4融合基因表达率高，常规化疗具有较高的缓解率，但易复发，allo-HSCT有可能改善其预后。
Keywords: 白血病，淋巴样, 脑啡肽酶, 基因重排，MLL, 预后
Abstract
Objective
To analyze the clinical features and prognosis of acute lymphoblastic leukemia patients with immunophenotype of CD10−pre-B (CD10− pre B-ALL).
Methods
6 adult cases with CD10− pre B-ALL immunophenotypes were analyzed retrospectively, related literatures were reviewed to clarify these kind of patients' clinical features and prognosis.
Results
CD10− pre B-ALL occurred in 1.5% of ALL, 1.8% of B-ALL and 11.5% of pre B-ALL respectively. All the 6 patients were male with the median age as 33.5 years old, the median white blood cells was 101.78×109/L, MLL-AF4 fusion transcripts were evident in all cases. Complete remission (CR) was achieved in 5 patients after first induction chemotherapy, 1 patient failed to respond to induction therapy, and got CR after 3 courses of chemotherapy. 2 patients underwent allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (allo-HSCT) in CR1, 1 patient relapsed in the short term and underwent allo-HSCT in CR2. 1 patient was still waiting for allo-HSCT. Of the 2 patients who didn't receive transplantation, 1 died following a relapse, the other remained to be in CR.
Conclusion
CD10− pre B-ALL was a rare but distinct subtype in adult ALL characterized by male dominance, high onset white blood cells and MLL rearrangement rate. Conventional chemotherapy produced a high response rate but more likely relapse, allo-HSCT may have the potential to improve the prognosis of these patients.
Keywords: Leukemia, lymphoid; Neprilysin; Gene rearrangement, MLL; Prognosis
急性淋巴细胞白血病（ALL）按照免疫表型主要分为B细胞型（B-ALL）和T细胞型（T-ALL）两大类。其中，前体B-ALL根据细胞发育程度又分为以下三个阶段：①早期前B-ALL（pro B-ALL；CD10−）；②普通型B-ALL（common B-ALL；CD10+）；③前B-ALL（pre B-ALL；胞质IgM阳性）[1]–[2]。大多数pre B-ALL患者CD10表达阳性，但少部分患者CD10表达阴性[2]。国外曾有文献报道，CD10阴性胞质IgM阳性的pre B-ALL（CD10−pre B-ALL）为一类特殊的ALL亚型，具有MLL基因重排发生率高、预后差的临床特征[3]。但目前尚未见国内文献对此类型的ALL进行报道。我们就我中心2009年1月至2016年3月收治的6例成人CD10−pre B-ALL患者进行了回顾性分析，现将其临床和实验室特征报道如下。
病例与方法
1．病例：2009年1月至2016年3月我中心共收治初诊成人ALL患者409例。所有患者均按照WHO 2008标准[2]确诊，同时参照欧洲白血病免疫学分型协作组（EGIL）诊断标准[4]除外急性混合表型白血病。根据免疫表型进一步划分，符合CD10− pre B-ALL患者共6例。本研究获得本单位伦理委员会批准，所有研究对象均签署知情同意书。
2．免疫表型分析：取患者骨髓（肝素抗凝）5 ml，溶解红细胞，常规进行相关抗体标记，PBS洗涤后上机（FACS Callibur多色流式细胞仪为美国BD公司产品）检测。所用抗体均为美国BD Pharmingen公司产品，包括B系CD19、CD20、cyCD22或CD22、CD10、CD79a、cyIgM、sIgM、FMC7，T系CD1a、CD2、cyCD3或CD3、CD4、CD5、CD7和CD8，髓系CD33、CD13、CD15、CD117、MPO、CD11b或CD11c、CD14和CD64，NK细胞相关CD16、CD56和前体细胞相关CD34、HLA-DR、CD38和TdT等。以淋系抗原阳性细胞≥30%、髓系和其他抗原阳性细胞≥20%、非系别特异性抗原阳性细胞≥20%为阳性表达标准。
3．细胞遗传学分析：取患者骨髓（肝素抗凝）5 ml，常规24 h的短期培养后，进行R显带分析染色体核型。异常核型依据《人类细胞遗传学国际命名体制（ISCN2013）》进行描述。
4．染色体FISH检测MLL基因重排：取患者骨髓（肝素抗凝）2 ml，直接法收获间期细胞，选择Vysis公司双色分离MLL探针，按试剂盒说明书对患者标本进行检测。
5．定性或定量PCR法检测MLL-AF4融合基因：由于检测年代和技术的原因，MLL-AF4融合基因的检测2例患者采用定性PCR法，4例患者采用定量PCR法。定量检测方法以ABL基因为内参，靶基因表达水平=靶基因拷贝数/ABL拷贝数×100%。
6．治疗：所有患者诱导治疗均采用VDCLP（长春新碱、柔红霉素、环磷酰胺、左旋门冬酰胺酶、泼尼松）方案。完全缓解（CR）后巩固强化治疗序贯给予CAMLV（环磷酰胺、阿糖胞苷、巯嘌呤、左旋门冬酰胺酶、长春新碱）、HD-MTX（大剂量甲氨蝶呤）、VDLD（长春新碱、柔红霉素、左旋门冬酰胺酶、地塞米松）等方案交替治疗。1例患者先后经VDCLP、CAMLV方案诱导化疗均未缓解，第3个疗程给予FA（氟达拉滨、阿糖胞苷）方案化疗后达CR。有移植条件患者在第1次CR（CR1）期行异基因造血干细胞移植（allo-HSCT），无移植条件者化疗结束以后给予VMMP（长春新碱、甲氨蝶呤、巯嘌呤、泼尼松）方案维持治疗。采用三联药物（阿糖胞苷+甲氨蝶呤+地塞米松）鞘内注射预防中枢神经系统白血病。
7．随访：随访截止时间为2016年4月30日，通过电话或病案查询方式进行随访。
结果
1．CD10−pre B-ALL以及MLL-AF4发生率：409例ALL患者中B-ALL 343例（83.9%），T-ALL 66例（16.1%）。将前体B-ALL按照免疫表型进一步划分，其中pro B-ALL 33例，占B-ALL的9.6%，common B-ALL 258例，占B-ALL的75.2%，pre B-ALL 52例，占B-ALL的15.2%。52例pre B-ALL患者中，46例患者CD10+，6例患者CD10−。CD10− pre B-ALL占ALL的1.5%，占B-ALL的1.8%，占pre B-ALL的11.5%。伴有MLL-AF4融合基因表达的患者17例（占B-ALL的5.0%，占ALL的4.2%），其中11例为pro B-ALL（占pro B-ALL的33.3%），余6例为CD10−pre B-ALL。
2．临床特征：6例CD10−pre B-ALL患者均为男性，中位年龄为33.5（15~51）岁。3例患者以乏力起病，2例患者以出血起病，1例患者以骨痛起病。起病时中位WBC为101.78（37.11~210.77）×109/L，中位HGB为101（55~131）g/L，中位PLT为20（11~43）×109/L，中位乳酸脱氢酶为612.5（335~800）U/L。6例患者骨髓原始+幼稚淋巴细胞均>0.750（表1）。
表1. 6例CD10阴性的前B急性淋巴细胞白血病患者的临床资料.
| 例号 | 性别 | 年龄（岁） | WBC（×109/L） | HGB（g/L） | PLT（×109/L） | LDH（U/L） | 骨髓原始+幼稚淋巴细胞 |
| 1 | 男 | 30 | 37.11 | 131 | 16 | 800 | 0.870 |
| 2 | 男 | 15 | 40.61 | 122 | 43 | 455 | 0.945 |
| 3 | 男 | 34 | 56.43 | 80 | 29 | 502 | 0.925 |
| 4 | 男 | 51 | 147.13 | 55 | 17 | 773 | 0.965 |
| 5 | 男 | 33 | 210.77 | 71 | 23 | 335 | 0.750 |
| 6 | 男 | 44 | 174.31 | 122 | 11 | 723 | 0.920 |
3．免疫表型：17例MLL-AF4融合基因阳性患者免疫表型均为CD10−，其中6例CD10−pre B-ALL患者的免疫表型情况详见表2。该类患者CD10阴性胞质IgM阳性，CD19、CD22、CD79a等B细胞标志常为阳性，但CD20阳性少见，多伴有CD34、HLA-DR、CD38、CD123等干/祖细胞的标志。CD13、CD33等髓系抗原在此类患者中较少表达。
表2. 6例CD10阴性的前B急性淋巴细胞白血病患者的实验室检查、治疗以及转归.
| 例号 | 免疫表型 | 核型 | FISH检测MLL基因（阳性细胞率，%） | MLL-AF4水平（%） | 达CR疗程数 | allo-HSCT | 移植时机 | 转归 | 生存期（月） |
| 1 | CD19/CD22/cIgM/TdT/CD34/HLA-DR/CD38 | 46,XY,t（4;11）（q21;q23）[7] | 97.2 | +a | 1 | 否 | − | 死亡 | 10 |
| 2 | CD19/CD22/CD79a/cIgM/TdT/HLA-DR/CD123/CD38 | 46,XY[12] | 92.8 | +a | 3 | 是 | CR2 | 生存 | 28 |
| 3 | CD19/CD22/CD79a/cIgM/TdT/CD34/CD123/CD15 | 47,XY,+? X,t（4;11）（q21; q23）[5]/46,XX[15] | 79.6 | 107.12 | 1 | 是 | CR1 | 生存 | 17 |
| 4 | CD19/CD22/CD79a/cIgM/TdT/CD34/CD123/CD38/CD33/CD56 | 46,XY,t（4;11）（q21;q23）[10] | 96.0 | 22.06 | 1 | 否 | − | 生存 | 16 |
| 5 | CD19/CD22/CD79a/cIgM/HLA-DR/CD123/CD38 | 46,XY,t（4;11）（q21;q23）[3]/46,XY[17] | 44.8 | 98.83 | 1 | 是 | CR1 | 生存 | 7 |
| 6 | CD19/CD22/CD79a/cIgM/HLA-DR/CD123/CD38 | 46,XY,t（4;11）（q21;q23）[14]/46,XY[6] | 65.0 | 54.13 | 1 | 等待 | − | 生存 | 1 |
注：CR：完全缓解；allo-HSCT：异基因造血干细胞移植；a此2例患者只进行了MLL-AF4融合基因的定性检测，未行定量
4．细胞遗传学特征：6例患者均进行了染色体核型检查，其中5例患者染色体核型发现t（4;11）（q21;q23），1例患者为正常核型。同时使用MLL探针对间期细胞进行检测，发现所有患者均伴有MLL基因重排，阳性细胞率为44.8%~97.2%。
5．分子生物学特征：PCR检测结果显示所有患者MLL-AF4融合基因阳性，有2例患者只进行了定性检测，余下4例患者进行了定量检测，MLL-AF4融合基因水平为22.06%~107.12%。
6．疗效：5例患者经1个疗程诱导化疗即获得CR，1例患者经3个疗程化疗后才获得CR。已有3例患者进行了allo-HSCT，其中2例患者的移植在CR1期进行，1例患者缓解后短期内即复发，在CR2期进行了allo-HSCT。2例未移植患者1例复发死亡，1例尚处于缓解状态。新近诊断的1例患者目前处于巩固化疗阶段，正在等待移植。
7．生存期：截止到末次随访日，6例患者中有1例死亡，生存期为10个月，5例存活患者的生存期为1~28个月。
讨论
CD10是一种相对分子质量为100×103的细胞表面中性肽链内切酶，属于锌依赖性金属蛋白酶范畴。由于最早发现于ALL患者骨髓细胞，又称为普通型急性淋巴母细胞性白血病抗原（CALLA）[5]。生理情况下，CD10广泛表达于人类多种细胞，并对B淋巴细胞的生长和增殖具有重要的调控作用[6]。而在B-ALL的诊断中，CD10是划分细胞发育阶段的重要抗原。根据WHO2008分型标准，前体B-ALL按照细胞发育程度及细胞表面抗原表达情况划分为pro、common、pre三个阶段。Pro B-ALL患者CD10均不表达，common B-ALL患者均表达CD10，而胞质IgM阳性的pre B-ALL患者中大多数CD10表达阳性，少部分患者CD10表达阴性[2]。Gleissner等[3]最早于2005年提出，CD10阴性胞质IgM阳性的pre B（CD10−/cyIgM+pre-B ALL）为一类特殊的ALL亚型，占成人ALL的2.2%。我们的结果显示，409例成人ALL患者中CD10−pre B-ALL患者6例，占ALL的1.5%，均伴有MLL基因重排，与国外文献报道类似。
混合谱系白血病（mixed lineage leukemia，MLL）基因位于11q23，是血液系统恶性疾病中较常累及的基因之一。文献报道MLL基因重排所涉及的伙伴基因发生率由高到低分别为AF4、AF9、ENL、AF10、AF6、ELL、AF1P[7]。其中，MLL-AF4主要见于B-ALL，以pro-B免疫表型为主，占成人ALL的3%~6%[3]。该类型白血病的免疫表型一般具有以下特点：CD10−/CD24−，多伴有髓系抗原CD65w以及CD15的表达[8]。CD10−通常被认为是早期淋巴细胞的标志，而同时合并CD65w+以及CD15+又提示此类型白血病细胞有可能起源于淋巴粒单核祖细胞（lymphomyelomonocytic progenitor cell）[9]。由于这种抗原表达的独特性，曾有文献报道使用白血病细胞表面抗原表达情况预测MLL基因重排的发生。该研究发现，CD10−、CD13−、CD33−以及CD65w+预测B-ALL发生MLL基因重排的敏感性均为1.00，而特异性分别为0.78、0.11、0.11以及0.89[9]。我们的研究结果显示，MLL-AF4+的B-ALL占成人ALL的4.2%，免疫表型均为CD10−，CD13、CD33等髓系抗原表达少见，与文献报道一致。6例患者中只有1例患者伴有CD15表达，这点与国外文献报道不符。由于CD24以及CD65w没有作为常规抗原进行检测，故上述2种抗原的表达情况不得而知。
成人ALL预后分组将pro B-ALL免疫表型划分为高危组[1]，其中部分原因是由于该免疫表型的B-ALL发生MLL基因重排的概率较高，而合并MLL基因重排的B-ALL容易复发，预后不良。国外文献报道，CD10−pre B-ALL在成人和儿童ALL中的发生率分别为2.2%和1.8%，并且MLL基因重排的发生率分别高达82%和64%。与儿童pro B-ALL类似，儿童CD10− pre B-ALL也多见于年龄<1岁的婴儿白血病患者。因此，pro B-ALL和CD10− pre B-ALL虽然具有不同的免疫表型，而生物学特征却非常类似，容易合并MLL基因重排，可作为同一类ALL亚型对待[3],[9]。Ikawa等[10]在MLL-AF4+婴儿白血病患者的研究中发现，CD10基因启动子调控区域的高度甲基化导致CD10基因的沉默，从而使该类型患者的免疫表型表现为CD10阴性。然而CD10的表达与MLL基因重排之间的具体作用机制目前尚无定论。
我们在研究中也发现，6例CD10−pre B-ALL患者均合并MLL-AF4融合基因，起病时白细胞水平较高，与pro B-ALL的特征非常类似，这与文献报道一致。但国外文献无论是关于MLL-AF4+的B-ALL（大部分为pro B）还是CD10−pre B-ALL的研究中均发现患者以女性为主[3],[11]，而在本研究中我们却发现6例患者均为男性。这种性别差异是否与种族有关，还需要大规模的队列随访研究得以证实。
本研究中有3例患者进行了allo-HSCT，目前均存活。对于MLL-AF4+患者，allo-HSCT可以明显改善预后，减少复发[11]。由于CD10−pre B-ALL患者的MLL基因重排发生率高，此类型患者应在CR1期尽量考虑行allo-HSCT。
综上所述，CD10−pre B-ALL是一类具有独特临床特征的成人ALL亚型，发生率较低，常见于男性，起病时白细胞水平较高，MLL-AF4融合基因表达率高，常规化疗具有较高的缓解率，但易复发，allo-HSCT有可能改善其预后。
Funding Statement
基金项目：国家科技支撑计划（2014BAI09B12）；天津市应用基础及前沿技术研究计划（15JCZDJC36400）
Fund program: National Science & Technology Pillar Program（2014BAI09B12）; Tianjin Major Research Program of Application Foundation and Advanced Technology（15JCZDJC36400）
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