骨髓造血衰竭分子遗传学研究进展

骨髓造血衰竭（Bone marrow failure, BMF）是一组以外周血一系或多系血细胞减少，骨髓相应造血细胞系列增生绝对（或相对）低下或增殖分化异常为突出特征的综合征。包含先天性和获得性BMF等多种不同类型，发病机制各异而血液学特征和临床表现相似。随着基因检测技术的进步，特别是二代测序和计算机生物分析方法应用于临床，极大地拓展和深化了对BMF的认识，先天性BMF新的胚系致病基因突变的识别、疾病临床表现异质性、患者转归以及克隆性血液学异常并发症的发生等与分子遗传学改变的关系不断得以揭示[1]–[3]。分子遗传学研究在骨髓增生异常综合征（MDS）发病机制、诊断、分型、预后分析及指导治疗等方面的进展已有较多介绍，我们现就其他类型BMF分子遗传学研究进展综述如下。

一、先天性BMF

1．精确诊断：先天性BMF的发生通常与参与重要生物学过程，如DNA修复、端粒生物学、核糖体生物合成等编码蛋白的基因突变相关，涉及数十种不同基因和众多基因位点。借助筛查试验，具有典型临床表现和家族史的患者，其倾向性诊断多无困难；而确定诊断，尤其是基因分型诊断颇具挑战，传统上主要采用家系调查连锁分析，或扩增测序已知的可疑致病基因，不仅耗时费力，成功率也非常低。目前已知16个范可尼贫血（Fanconi anemia, FA）亚型，9个先天性角化不良症（Dyskeratosis congenita, DC）相关基因，12个先天性纯红细胞再生障碍（Diamond-blackfan anemia, DBA）基因，将已知的先天性BMF基因整合入基因芯片进行二代靶向基因测序可识别新诊断的大约95% FA、70% DC和50% DBA相关先天性BMF基因突变[4]。Ameziane等[5]采用整合了8个FA基因的靶向基因测序检测11例患者，不仅检出已知突变，而且还识别出此前未曾报告的新的突变位点。De Rocco等[6]检测100例FA患者及亲属的基因突变情况，明确了108种突变，其中有45种突变是新发现的FA相关突变。同样地，将已知的DBA相关基因连同其他编码核糖体蛋白的基因共79个组成靶向基因芯片检测临床诊断的患者，可以明确其基因异常并评估新的可能潜在致病的DBA相关基因[4]。Gerrard等[7]采用二代测序分析了80例DBA患者，结果发现以RPL5突变最为常见，其次是RPS26和RPL11突变，RPS17、RPS10、RPS19、RPS24和RPS7突变仅见于少数患者，并且不同种族患者RPS19基因突变频率明显不同。较之毛细管Sanger测序法，二代靶向基因测序可同时对多个兴趣基因进行高通量平行深度测序，作为具有大量变异基因型和突变位点而临床表现相似的综合征，先天性BMF较适用。

迄今，先天性BMF基因异常并未完全阐明，采用全外显子或全基因组二代基因测序可加快对少见的、遗传学异常未知患者的识别。应用全外显子测序在1例临床典型表现的FA患者发现编码DNA修复内切酶XPF的ERCC4基因异常，命名为FANCQ/ERCC4；有研究证明编码端粒帽盖蛋白的CTC1基因复合杂合突变，和编码参与端粒长度调节的RTEL1蛋白基因突变，导致常染色体隐性或显性遗传性DC，使DC基因诊断阳性率由原来的50%提高至70%左右[4]。

除此之外，已知的先天性BMF类型又多具有不典型临床表现，而某些BMF患者具有躯体畸形、阳性家族史等，疑似或者提示为先天性BMF，但又不完全符合任一已知的先天性BMF类型。因而，单纯依据临床和血液学检查以推断和辨别先天性BMF类型有时非常棘手。二代基因测序可方便地解决这一难题，揭示患者存在的基因异常，将前期不能诊断的患者合理归类。如，先天性神经性耳聋与BMF家系的SRP72胚系基因突变、早发血小板减少与皮肤白化患者SBF2基因纯合突变以及先天性粒缺和骨髓纤维化患者胚系VPS45基因纯合突变等[4]。

胚系突变的识别对于先天性BMF的诊断和治疗随访非常重要。鉴于不同类型先天性BMF表现相似，而特定类型先天性BMF表现常不典型，并且基因型与表现型的关系因样本数较小尚未充分阐明，临床如何合理有序地选择诊断试验非常困难。虽不大可能完全替代筛查试验，但对高度疑似病例二代基因测序技术以其更好的性价比和高通量快捷特质，通常可满足精确诊断之目的。

2．基因型与表现型：先天性BMF除进行性骨髓造血衰竭外，通常还伴有躯体畸形、发育迟缓和肿瘤易感[4]。然而，临床上不典型表现患者并非少见，如大约20% FA患者无畸形，某些DC患者无典型指（趾）甲发育不良、口腔黏膜白斑和皮肤色素沉着“三联征”甚至某些临床表现典型的FA患者，其特征性DNA交联剂诱导的染色体脆性试验（MMC试验、DEB试验）也可阴性。这可能与先天性BMF发病涉及的基因不同，或同一基因突变位点不同、突变基因回复性嵌合、同时复合其他胚系基因异常，或受修饰基因影响等有关，采用常规实验室方法难以识别和解释这些异质性表现型。

研究发现FANCA占所有FA患者的70%左右，其中又包含几百种不同的突变类型。通常无义突变导致蛋白合成完全缺失，其临床表现型较其他突变类型者更为严重；临床上伴有最严重躯体畸形表现的VACTERL-H综合征（V：脊柱畸形；A：肛门闭锁；C：心脏畸形；T：食管-气管漏；E：食道闭锁；R：肾脏畸形；L：肢体畸形；H：脑积液）常见于FANCC IVS4+4 A>T、FANCD1/BRCA2、FANCD2、FANCG、FANCI和FANCN/PALB2亚型；早发造血衰竭更常见于FANCA、FANCC IVS4、FANCG与FANCI；白血病、髓母细胞瘤、Wilms瘤则更常见于FANCD1/BRCA2和FANCN/PALB2亚型[8]。采用全外显子测序方法，Savage[9]研究结果表明脑视网膜微血管病伴发钙化与囊变（Cerebroretinal microangiopathy with calcifications and cysts, CRMCC）与DC同为编码端粒帽盖蛋白的CTC1基因复合杂合突变所致，该突变导致端粒明显缩短，临床上可表现为CRMCC或典型DC，也可同时CRMCC和DC征象叠合表现。Keller等[10]检测一典型临床表现的DC患者，证明是以常染色体隐性遗传方式CTC1基因突变致病。同样，以往认为GATA1突变仅与X连锁先天性红细胞生成异常性贫血和血小板减少相关[11]，Sankaran等[12]采用全外显子测序在两个DBA家族中发现X连锁胚系GATA1突变也可通过目前未知的机制导致DBA。这些表现型的差异可能与GATA1突变对其结合蛋白影响效应不同所致。

临床上，造血衰竭的不典型表现还可能由两种少见综合征叠合所致。Cullinane等[13]报告1例父母为近亲结婚女性患者，临床表现为嗜中性粒细胞缺乏、皮肤结节性白斑和出血性腹泻，全外显子测序发现该患者同时具有可导致先天性粒细胞缺乏的G6PC3纯合突变和Ⅳ型皮肤结节性白化症相关的SLC45A2基因纯合突变。

二代基因测序技术的应用正在改变着BMF，特别是先天性BMF的诊断模式，即由原倾向性诊断驱动试验检查转化为广泛的基因特征筛查模式。精确诊断和对基因型与表现型关系的厘清不仅有助于对先天性BMF发病机制认识的加深，还可指导治疗策略制订和造血干细胞移植供者的遴选。

二、获得性BMF分子研究进展

1．再生障碍性贫血（Aplastic anemia, AA）克隆性造血演变：

AA主要是由免疫介导的骨髓造血衰竭综合征，除造血干祖细胞池明显萎缩、外周血细胞减少外，患者尚经常伴发克隆性造血异常，以逃避异常免疫攻击，获得相较正常造血干细胞更多生存优势。阵发性睡眠性血红蛋白尿症（Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria, PNH）克隆、+8染色体、杂合性6p−异常和del 13q异常最为多见，发生于包括AA初始诊断的任何疾病阶段。15%~20%的患者晚发克隆性血液学异常，主要为MDS和急性髓系白血病（AML），而长久以来对其克隆性演变的机制所知甚少[14]–[15]。由于AA转化为MDS和AML预后均非常恶劣，因而对晚发克隆性血液学异常的预测、诊断和始动干预的临床要求非常迫切。正是最近二代测序技术的应用开启了该领域认识的大门，自从2013年Lane等[16]报告深度测序用于检测AA基因突变以来，又有数个研究组报告AA二代基因测序结果，报告的突变率从最低5.3%到最高72%不等[16]–[18]。

X染色体灭活式样分析为基础的克隆性研究早已证实，正常人群随着年龄增大造血细胞克隆偏颇发生的概率也明显增多，年龄大于60岁的正常女性获得性偏颇造血的概率高达38%[19]。Jaiswal等[20]对未有血液学异常表现的17 182名人群进行外周血细胞160种目前已知的与髓系和淋系肿瘤相关基因分析，发现746例（4.3%）存在体细胞基因突变，以DNMT3A、TET2和ASXL1基因突变最为常见。体细胞突变在40岁以下人群非常少见，70岁以上者造血细胞克隆性突变发生率达10.1%（275/2 720）。无独有偶，Babushok等[17]的研究提示65岁以上人群中10%伴有体细胞突变克隆性造血，并且随年龄增大发生克隆性造血的倾向也更加明显，伴有基因突变克隆性造血者，其罹患血液肿瘤的风险也明显增大，较未检出克隆性造血者高十倍以上[21]。Genovese等[17]还报告随访研究中发生血液肿瘤的患者，早在肿瘤诊断前至少6个月就曾检测出造血细胞克隆性增殖，提示造血细胞基因突变可能是导致克隆性造血扩增的癌前病变事件[20]。尽管如此，获得克隆性造血者绝大多数并不进展为MDS和髓系白血病，少部分会出现血细胞减少，这一类患者应诊断为发展倾向未定的克隆性造血（CHIP），其临床意义与未知的单克隆丙种球蛋白血症（Monoclonal gammopathy of unkown significance, MGUS）和单克隆B淋巴细胞增多症（Monoclonal B-cell lymphocytosis, MBL）一致，为血液肿瘤前期状态，通常呈良性过程、较少进展。Steensma等[22]–[23]提出CHIP诊断标准：①无血液肿瘤确定性细胞形态证据；②不符合PNH、MGUS或MBL标准；③血液学肿瘤相关的体细胞突变变异位点频率≥2%；④进展为肿瘤的概率与MGUS相似，每年0.5%~1%。

鉴于克隆性造血在血液学正常的人群并非少见，并且尚无证据表明CHIP克隆性造血发生机制与AA伴克隆性造血演变机制一致，因而，获得性AA患者，尤其老年AA患者，二代基因测序检出的髓系肿瘤相关基因突变与AA疾病本身的关系和意义需要更多研究加以阐明。

AA二代基因测序体细胞突变具有以下特征：①体细胞突变通常涉及与免疫逃逸（PIGA）和信号传导（STAT5B）相关基因，MDS相关基因突变相对少见[17]；②最常见的突变基因包括PIGA、BCOR、BCORL1、DNMT3A和ASXL1，其他基因突变相对较为少见；③突变位点负荷通常较低，75%的突变其突变负荷<10%[18]；④PIGA、BCOR、BCORL1突变克隆随病程延长克隆大小稳定或逐渐减小，而DNMT3A和ASXL1突变倾向于逐渐增大；⑤相对于“有益突变（favorable mutations）” PIGA、BCOR和BCORL1突变而言，DNMT3A、ASXL1、TP53、RUNX1和CSMD1基因突变与更快进展为MDS相关，免疫抑制治疗血液学反应率低、生存期短，是为“不利突变（unfavorable mutations）”；⑥动态突变克隆监测显示，大多数患者数年保持小突变克隆状态，而进展为MDS者其突变克隆无一例外地逐渐增大；⑦伴有体细胞突变的AA较未有突变者晚发MDS的风险明显增大（38%对6%，P<0.001）。

AA伴发克隆性造血很是常见，尽管部分患者最终逐渐进展成临床典型的MDS和AML，但多数患者仍能持久地保持正常造血。目前对于”有益突变”和“不利突变”克隆选择的机制还知之甚少，检测体细胞突变，密切监测其克隆演变将可能有助于预测和早期诊断MDS、AML，并更加精准地制订AA合理治疗策略。

2．PNH造血亚克隆：

PNH是一非恶性的克隆性造血干细胞疾患，临床表现为慢性持续性血管内溶血阵发性加重、骨髓造血衰竭和血栓形成倾向。该病主要是由X染色体短臂（Xp 22.1）的PIGA基因突变，导致细胞膜表面锚蛋白缺失，失缺CD55、CD59保护，补体途径激活溶解红细胞所致[24]。除正常造血细胞外，PNH患者还存在1个或2个PIGA基因突变造血克隆，生成锚蛋白缺失的异常红细胞，其中部分缺失锚蛋白红细胞为Ⅱ型细胞，锚蛋白完全缺失者为Ⅲ型细胞。PNH患者的PIGA基因突变包括基因片段的插入、缺失和点突变，PIGA基因点突变更倾向于形成Ⅲ型细胞[25]。

曾有表现典型血管内溶血、腹痛、乏力等PNH症状的患者，经二代测序检测分析发现非X染色体短臂PIGA基因突变，而是由位于常染色体上的PIGT基因缺失的干细胞克隆性增殖所致，表明PIGA基因突变并非唯一造成PNH发病的原因。体外实验中将PIGT失活的细胞中转入野生型PIGT基因，细胞表面锚蛋白和CD55、CD59水平都会提高，即转为正常细胞或Ⅱ型细胞；转入PIGT突变基因只表现出CD55轻度提高，CD59几乎不表达，即仍为Ⅲ型细胞。只有PIGT基因突变纯合子才会出现锚蛋白缺乏，出现PNH的临床表现；杂合型PIGT突变只会增加患病可能[26]。PIGT基因突变对于PNH的意义还不能确定，或许PIGT基因突变会诱发PIGA基因突变，具体机制还有待进一步研究证明。

大部分PNH患者存在与肿瘤发生相关的基因突变，如TET2、SUZ12、ASXL1、BCOR、JAK2和U2AF1等。有研究表明伴多种基因突变的克隆较PIGA单基因突变存在概率更高，其他附加的基因突变可以是PIGA基因突变的亚克隆，但也可能先于PIGA基因突变存在，甚至与PIGA基因突变共存。这类基因突变可能改变PIGA突变的生物学功能，从而造成PNH临床症状的出现。PIGA突变与肿瘤相关突变基因的关系存在以下4种情况：①PIGA突变是起始、甚至先天的突变，其他肿瘤相关的基因突变是获得性的；②PIGA突变继发于肿瘤相关基因突变，但是其他突变几乎完全被PIGA突变替代，即PIGA以外的基因突变只能被定义为伴随突变；③PIGA突变继发于其他肿瘤相关基因突变，但只是作为亚克隆存在以获得额外的增殖优势；④骨髓发育异常与PNH克隆独立共存，如PIGA突变与JAK2突变共存时表现出完全不同于骨髓增殖性肿瘤的临床表现[27]。二代测序的应用有助于明确异常细胞形成原因，以及两种异常细胞不同比例的形成原因，而且能够更准确地量化PNH克隆的大小和组成，有利于发现本病基因型和基因表型之间的关系[28]。

二代基因测序技术的应用使得分子生物学标志可以高通量、高灵敏度方式检测获得，而不再分别测序。与在其他胚系遗传性疾病、实体瘤和血液肿瘤一样，其快速、大量的信息提供也深刻影响着骨髓造血衰竭疾患基础认识和临床实践。目前相关的数据积累较少，还需要进一步完善明确其临床指导意义。