慢性淋巴细胞白血病（chronic 1ymphocytic leukemia，CLL）是一种成熟B淋巴细胞克隆增殖性肿瘤，其遗传学特征对疾病的发生、发展及预后具有重要意义。CLL的发病率在不同国家有很大差别，欧美和北美地区CLL占所有白血病总数的25%~40%，而在亚洲地区CLL仅占白血病的5％以下[1]，体现出一定的种族差异性。鉴于维吾尔族具有独特而复杂遗传背景[2]，且CLL发病率较高，推测维吾尔族CLL患者的遗传学特征可能与汉族患者存在一定的差异，故我们收集新疆维吾尔族和汉族CLL患者各30例开展此项前瞻性临床研究，分析并比较其常规细胞遗传学（CC）及FISH结果，以了解维吾尔族CLL患者遗传学特征与汉族患者有无差异性。
对象与方法
一、研究对象
收集2013年4月至2015年4月确诊为CLL的60例初诊患者，每例患者均行血常规、骨髓细胞形态学、骨髓活检、染色体核型分析、FISH检测、流式细胞术及超声检查等。诊断与分期均参照《中国慢性淋巴细胞白血病的诊断与治疗指南（2011年版）》[3]。每例患者要求至少2代人在新疆居住生活。其中汉族30例，维吾尔族30例；男性35例（汉族19例、维吾尔族16例），女性25例（汉族11例、维吾尔族14例），男女比例为1.4∶1；中位年龄为70（30~86）岁，≥60岁46例（76.7%），<60岁14例（23.3%）。临床分期按照CLL Binet分期方法，A期18例（30.0%），B期20例（33.3%），C期22例（36.7%）；按照Rai分期方法，0期4例（6.7%），1期13例（21.7%），2期21例（36.70%），3期7例（11.7%），4期15例（25.0%）；按修改后的Rai分期标准分为低危4例（0期），中危34例（1、2期），高危22例（3、4期）。随访日期截至2016年3月。
二、检测方法
1．染色体标本制备：行CPG-ODN刺激法制备染色体[4]。取患者骨髓液5 ml置于肝素抗凝管中，按照细胞密度为（2~3）×106/ml接种于含20％新生小牛血清的RPMI 1640培养液内，加CPG-ODN刺激剂，37 °C培养96~108 h，终止培养前3 h加入秋水仙碱，再以0.075 mmol/L氯化钾溶液低渗处理30 min，用3∶1的甲醇、冰醋酸溶液反复固定3次，火焰固定法制片，用R显带技术（87.5 °C加热法）进行显带，吉姆萨染色，光学显微镜下分析染色体核型。每例患者分析20个中期分裂象，核型分析按照人类细胞遗传学国际命名体制（ISCN) 2009的有关规定加以描述。至少有2个细胞有同样的染色体增加或结构异常，或至少有3个细胞有一致的染色体丢失确认为1个异常克隆，具有3个或3个以上不相关的异常克隆[除外合并存在t (8;21）、t (15;17）、t (9;22）等异常]确定为复杂核型。
2．FISH检测：采用组合CLL FISH探针试剂盒：13q14（D13S25、Rb1）、11q23（ATM）、17p13 (p53）、12号染色体着丝粒（CSP12）。探针购自北京金菩嘉医疗科技有限公司，依据说明书进行操作：分别加入光谱绿标记的GLP p53探针、GLP Rb1和光谱红标记的GLP D13S25探针、GLP ATM探针、CSP 12探针，进行变性杂交、快速洗脱、复染后，用OLYMPUS BX51荧光显微镜在DAPI/FITC/TRITC三色滤光镜激发下观察中期和间期细胞荧光杂交信号。正常骨髓细胞见2对红色（2R）或2对绿色（2G）荧光信号，CLL患者中异常典型的阳性信号为p53缺失：1G（绿色）、Rb1：缺失1G（绿色）、D13S25缺失：1R（红色）、ATM缺失：1R（红色）、12号三体：3R（红色）。计数200个细胞，计算异常细胞所占的百分率。结果分析时随机计数血液样本细胞。计数细胞必须是各通道信号均清晰可辨的细胞。细胞核轮廓不清或有重叠的不计数。杂交不均匀的区域不计数。以10名健康人为对照组，制备玻片及进行FISH实验。每份样本至少分析200个细胞，计算出显示异常信号的细胞数、百分比的平均值及标准差，异常阈值定义为平均值+3倍标准差。每例样本随机计数200个细胞，如果显示异常信号细胞比例的检测值大于异常阈值，判定为阳性结果；如果显示异常信号细胞比例的检测值小于异常阈值，判定为阴性结果。如果显示异常信号细胞比例的检测值接近异常阈值，加数至1 000个细胞。
三、治疗
治疗指征及治疗方法参见《中国慢性淋巴细胞白血病的诊断与治疗指南（2011年版）》[3]。
四、统计学处理
所有数据采用SPSS 17.0软件，核型和基因异常率比较、累及基因数在低中危／高危组分布差异采用卡方检验，Kaplan-Meier法计算生存率并绘制生存曲线，核型和各基因组正常与异常患者间的中位生存时间比较采用Log-rank检验。P<0.05认为差异有统计学意义。
五、伦理审查
本研究于2013年通过我院伦理委员会审批，每例入选患者均签署知情同意书。
结果
1．一般比较：60例CLL患者，汉族和维吾尔族患者各30例，年龄≥60岁各23例，<60岁各7例。汉族男性19例，女性11例；维吾尔族男性16例，女性14例，比较汉族与维吾尔族的年龄及性别分布差异无统计学意义（χ2=0.0，P=0.619；χ2= 0.617，P=0.300）。汉族在低中危、高危组分别为20、10例，维吾尔族在低中危、高危组分别为18、12例，汉族与维吾尔族患者在低中危／高危组中分布差异无统计学意义（χ2=0.287，P=0.789）。
2．CC核型结果：60例CLL患者中染色体异常检出率为31.7%（19/60）。正常／异常核型在汉族／维吾尔族CLL患者中分布差异无统计学意义（χ2= 0.077，P=1.000）。正常核型在低中危、高危组分别为30、11例，而异常核型在两组中分别为8、11例，比较发现核型正常与异常在低中危/高危组中分布差异有统计学意义（χ2= 5.396，P=0.042）。异常核型中数目异常13.3%（8/60）、结构异常13.3%（8/60）、数目结构合并异常5%（3/60）。比较这几种异常在汉族／维吾尔族（χ2= 0.858，P=0.887）和低中危组／高危组（χ2=6.321，P=0.082）中分布差异均无统计学意义。异常染色体主要涉及13号占15%（9/60），+12占15%（9/60），11号5%（3/60），1号3.3%（2/60），6、7、14、Y各1例。
3．I-FISH分析基因组异常：60例CLL患者中检出43例（71.7%）基因异常，其中D13S25阳性32例（53.3%），RB1阳性12例（20%），CSP12阳性8例（13.3%），ATM阳性8例（13.3%），P53阳性4例（46.7%）；比较发现5种探针不同异常在汉族／维吾尔族、低中危／高危组CLL患者中分布差异均无统计学意义（P值均>0.05）。D13S25、RB1、ATM、P53、+12等异常信号细胞比例的检测值中位数分别为58%、62%、75%、46%、46%。
4．染色体核型分析与FISH检测比较：60例CLL患者中CC检出19例（31.7%）异常，FISH检出43例（71.7%）异常，异常检出率FISH组明显高于CC组（χ2=7.288，P=0.006）。19例CC检出异常者中18例被FISH检出，1例异常为组合探针外异常，FISH检测不能识别；41例CC检测为阴性者25例（61.0%）FISH检测出异常，D13S25阳性23例（38.3%），RB1阳性6例（10.0%），CSP12阳性未见，ATM阳性4例（6.7%），P53阳性1例（1.7%）。
讨论
欧美国家CLL的发病率显著高于亚洲地区，中位发病年龄65~70岁，男性患者居多，具有显著的临床预后异质性[3]。本研究发现汉族和维吾尔族CLL患者在年龄和性别分布上差异无统计学意义，中位发病年龄70岁，男性多于女性（男∶女=1.4∶1），与国内外报道相符。常规染色体核型分析仅20％的CLL患者可以检测到克隆性染色体异常，加用相关有丝分裂原刺激剂后有近50％的CLL患者可检测到染色体异常，FISH检测约有80％的CLL患者可检测到异常[4]–[5]，最常见的有del (13q14）、+12、del (11q23）、del (17P13）、del (6q23）。本研究加用CpG-寡脱氧核苷酸免疫刺激后，染色体核型异常检出率为31.7%，低于国内报道，考虑与病例数较少有关。染色体异常及FISH异常类型与相关报道基本一致。比较汉族和维吾尔族遗传学特征初步发现二者差异无统计学意义，可积累病例数进一步证实。
近年来大量研究表明，CLL患者染色体／基因异常与预后密切相关[6]，如单纯del (13q14）预后较好，生存期较长，不需要过多治疗干预；12号染色体三体的CLL患者的生存期和正常核型患者差异无统计学意义；P53缺失、ATM缺失率在疾病复发或恶性进展时较高，患者预后差，疾病进展快，生存期短[7]–[8]。
CLL经典预后积分系统多以单纯化疗时代的分析结果总结而来，随着利妥昔单抗、Ibrutinib、ABT199等新型药物的临床应用，CLL患者的疗效和缓解度不断提高[9]–[10]，以流式细胞术、PCR技术和靶向基因测序为代表的敏感检测技术日渐成为评估CLL疗效的新手段。今后以微小残留病、分子生物学异常、综合预后评分为代表的新型预后指标将不断丰富和完善现有的CLL预后体系[11]。
Funding Statement
基金项目：国家自然科学基金（81640033）；新疆维吾尔自治区人民医院科研项目（20130247）
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