Abstract
目的
以含有凝血因子Ⅸ（FⅨ）cDNA的pcDNA/FⅨ质粒为模板构建真核表达载体pIRES2-ZsGreen1/FⅨ并检测其在HEK-293细胞中的表达。
方法
以pcDNA/FⅨ质粒为模板，扩增出目的基因FⅨ的开放阅读框（ORF）区，使用Infusion酶对线性pIRES2-ZsGreen1双酶切产物及FⅨORF扩增产物进行连接，连接产物进行转化后筛选阳性克隆，对阳性克隆进行DNA测序及凝胶电泳鉴定。野生型pIRES2-ZsGreen1/FⅨ转染HEK-293细胞后，分别采用实时定量PCR、细胞免疫荧光法、一期法检测野生型FⅨ基因mRNA表达水平、蛋白的表达量及细胞裂解液、细胞培养液的FⅨ活性。
结果
成功构建pIRES2-ZsGreen1/FⅨ并转染HEK-293细胞，实时定量PCR证实HEK-293细胞表达FⅨ mRNA，激光共聚焦显微镜下观察到FⅨ蛋白在细胞质中合成，野生型质粒pIRES2-ZsGreen1/FⅨ转染HEK-293细胞裂解液和细胞培养液的FⅨ活性分别为（92.03±0.29）%、（86.89±8.78）%，无转染的HEK-293细胞裂解液和培养液中FⅨ活性均为0。
结论
成功构建FⅨ野生型pIRES2-ZsGreen1真核表达载体。
Keywords: 血友病B, 因子Ⅸ, 真核细胞, 质粒
Abstract
Objective
To construct pIRES2-ZsGreen1/F Ⅸ expression vector, using the pcDNA/FⅨ plasmid containing FⅨ cDNA as template, and express in HEK-293 cells.
Methods
The total ORF of F Ⅸ gene was amplified from pcDNA/F Ⅸ plasmid, then the amplified fragment was clonded into the pIRES2-ZsGreen1 vector using the Infusion enzyme. The positive clones of eukaryotic expression vector of pIRES2-ZsGreen1/F Ⅸ were screened and expanded after transfection, then were constructed and confirmed by PCR and sequencing. Transient expression experiments were performed using HEK-293 cells transfected with the expression vectors and observed the expression of ZsGreen1 protein by confocal laser microscope. The relative expression levels of FⅨ mRNA, protein and FⅨ activity (FⅨ∶C) were detected by real time PCR (RT-PCR), immunofluorescence microscopy, One-Stage method, respectively.
Results
The expression vector, pIRES2-ZsGreen1/F Ⅸ, was successfully constructed and expressed in HEK-293 cells. RT-PCR detected the expression of F Ⅸ mRNA in HEK-293 cells and the immunofluorescence microscopy showed FⅨ protein distributed in the surrounding of nucleus. FⅨ∶C of cell lysates and cell culture fluid transfected with the expression vectors were (92.03 ± 0.29)% and (86.89 ± 8.78)%, respectively; while both F Ⅸ∶C of cell lysates and cell culture fluid transfected with or without the expression vectors were 0.
Conclusion
The experimental results showed the expression vector, pIRES2-ZsGreen1/FⅨ, was successfully constructed, which provided experiment basement for the follow study on the location, function and molecular pathology of hemophilia B.
Keywords: Hemophilia B, Factor Ⅸ, Eukaryotic cells, Plasmids
血友病B是凝血因子Ⅸ（FⅨ）基因突变引起的X连锁隐性遗传性出血性疾病，在男性中的发病率约为1/25 000[1]，占血友病的15%~20%[2]。FⅨ基因位于Xq26.3–27.2，全长34 kb，由8个外显子和7个内含子构成[3]。FⅨ基因缺陷导致FⅨ活性或含量下降是血友病B的分子发病机制。本研究以含有FⅨ cDNA的pcDNA/FⅨ质粒为模板构建真核表达载体pIRES2-ZsGreen1 /FⅨ野生型，为研究FⅨ真核表达载体在HEK293细胞中的表达及血友病B的分子发病机制奠定实验基础。
材料与方法
1．主要试剂：含有FⅨ cDNA的pcDNA3.1（−）质粒pcDNA/FⅨ由上海瑞金医院王学锋教授惠赠；HEK-293细胞系购自美国ATCC公司；pIRES2-ZsGreen1、Infusion HD Cloning Kit购自日本Clontech公司；EcoRⅠ、BamHⅠ限制性核酸内切酶购自日本TaKaRa公司；PfuUltraTM HF DNA Polymerase购自美国Stratagene公司；Attractene转染试剂购自德国QIAGEN公司；鼠抗人FⅨ单克隆抗体购自美国Sigma公司；Dylight 649 Affinipure Goat Anti-Mouse IgG (H+L）购自美国Earthox公司；4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）购自德国Roche公司；PrimeScript RT reagent Kit反转录试剂盒和SYBR® Premix Ex Taq™试剂盒购自日本TaKaRa公司；实时定量PCR引物由大连宝生物公司合成。M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent购自美国Thermo Scientific公司。
2．以pcDNA/FⅨ质粒为模板构建真核表达载体pIRES2-ZsGreen1/FⅨ：将pcDNA/FⅨ及pIRES2-ZsGreen1质粒在感受态细胞E.coli DH5α转化、扩增，并提取相应质粒DNA。查找pcDNA/FⅨ质粒目的基因开放阅读框（ORF）区，在FⅨORF翻译起始位点及终止位点附近设计引物，扩增出目的基因FⅨ的ORF区，行琼脂糖凝胶电泳，回收PCR扩增的FⅨORF片段（1 434 bp）。以限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ对pIRES2-ZsGreen1质粒进行双酶切。pIRES2-ZsGreen1质粒全长5 283 bp，经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后产生32 bp及5 251 bp两个片段，凝胶电泳仅见5 251 bp一个条带，凝胶回收此片段。采用Infusion HD Cloning Kit将目的片断FⅨ ORF插入pIRES2-ZsGreen1载体中，连接产物长度为6 660 bp。连接产物在感受态细胞E.coli DH5α转化、扩增。Cracking Buffer法筛选pIRES2-ZsGreen1/FⅨ重组体的阳性克隆。根据pIRES2-ZsGreen1质粒的结构，以pIRES2-EGFP.P5′及pIRES2-EGFP.P3′为测序引物，采用双脱氧链终止法进行DNA序列分析。Chromas软件将测序结果与NCBI基因库（Gene Bank K02402.1）序列进行比对，验证载体构建是否成功。
3．野生型pIRES2-ZsGreen1/FⅨ质粒的转染：将处于对数生长期的HEK-293细胞用PBS洗涤2次，加0.25％胰酶消化后，计数2×104个细胞，接种于24孔细胞培养板，加完全DMEM培养基500 µl，置于37 °C、5% CO2培养箱中孵育。将0.4 µg质粒溶解于60 µl无血清DMEM培养液中混匀，加入1.5 µl Attractene转染试剂混匀，室温孵育10~15 min。将上述混合物加入到24孔板中，轻柔晃动培养板，保证转染混合物分布均匀，设3个复孔同步转染。将细胞置于37 °C、5% CO2培养箱中孵育24 h，弃去转染混合物，每孔加入500 µl完全培养基，继续培养48 h。转染48 h后，1×PBS洗涤细胞，更换新鲜培养液，激光共聚焦显微镜下观察ZsGreen1的荧光表达情况并拍照。
4．实时定量PCR检测FⅨ mRNA的表达：转染48 h后，倒出培养液，用E.Z.N.A.™ DNA/RNA/Protein Isolation Kit提取总RNA。去除基因组DNA，并用PrimeScript RT reagent Kit反转录试剂盒逆转录为cDNA。根据NCBI基因库公布的FⅨ基因cDNA序列（AF536327），设计实时定量PCR引物：FⅨ上游引物为5′-GGAGATCAGTGTGAGTCCAATCCA-3′，下游引物为5′-CTGCTCGCATCTGCCATTCTTA-3′，产物大小为150 bp；β-actin上游引物为5′-TCATCACCATTGGCAATGAG-3′，下游引物为5′-CACTGTGTTGGCGTACAGGT-3′，产物大小为155 bp。采用实时定量PCR检测FⅨ mRNA表达，反应体系：SYBR® Premix Ex Taq™Ⅱ（2×）10 µl，上下游引物各0.5 µl，ROX Reference Dye (50×）0.4 µl，cDNA模板2~4 µl，焦碳酸二乙酯（DEPC）处理水加至总体积20 µl。反应条件：95 °C预变性30 s; 95 °C变性5 s, 60 °C退火延伸30 s，共40个循环。每个标本设3个复孔，分不同批次完成。以无转染的HEK-293细胞为阴性对照。
5．细胞免疫荧光法检测FⅨ蛋白的表达：24孔板中置入干净玻片，加入HEK-293细胞，待细胞至90％融合后进行野生型FⅨ质粒转染。转染24 h后吸去培养基，用PBS洗细胞3次（每次5 min）。4%多聚甲醛室温下固定细胞15 min。0.2% Trition室温透化处理15 min。10％正常山羊血清封闭30 min。鼠抗人FⅨ单克隆抗体（1∶200) 4 °C孵育14~16 h。PBS洗细胞2次（每次5 min），Dylight 649 Affinipure Goat Anti-Mouse IgG (H+L）（1∶50) 37 °C孵育30 min。PBS洗细胞2次（每次5 min），加入DAPI（1∶1 000）染色15 min。滴加2~3 µl抗荧光衰减封片剂，指甲油封片。激光共聚焦显微镜下观察结果并照相。以转染pIRES2-ZsGreen1的HEK-293细胞为阴性对照。
6．一期法测定FⅨ活性（FⅨ∶C）：转染48 h后倒出培养液，每孔加入含有1%Halt Protease Inhibitor Cocktail的M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent 200 µl，将裂解液及培养上清液冻存。进行总蛋白浓度测定。采用一期法，乏因子血浆用1 ml蒸馏水溶解，使用前保持15~25 °C至少15 min，然后摇匀至溶解，吸取APTT试剂100 µl，37 °C温育4 min，加入乏因子血浆100 µl、待测蛋白100 µl，混匀，37 °C温育5 min。加入已预热至37 °C的0.02 mol/L CaCl2溶液100 µl，在全自动血凝仪上检测并记录凝固时间。每个标本设3个复孔，分不同批次完成。以无转染的HEK-293细胞作为阴性对照。
结果
1．pIRES2-ZsGreen1/F Ⅸ电泳及测序鉴定：pIRES2-ZsGreen1/FⅨ重组体长度为6 660 bp（图1），根据pIRES2-ZsGreen1质粒的结构，以pIRES2-EGFP.P5′及pIRES2-EGFP.P3′为测序引物，采用双脱氧链终止法进行DNA序列分析。Chromas软件将测序结果与NCBI基因文库（Gene Bank K02402.1）序列进行比对，拼接结果完全正确。
图1. pIRES2-ZsGreen1/FⅨ质粒琼脂糖凝胶电泳图.
1：DNA Marker；2~17：pIRES2- ZsGreen1/FⅨ；18：阴性对照
2．激光共聚焦显微镜下观察pIRES2-ZsGreen1/FⅨ转染：转染48 h后，1×PBS洗涤细胞，更换新鲜培养液，激光共聚焦显微镜下观察ZsGreen1荧光表达情况并拍照。未转染HEK-293细胞中无绿色荧光，转染pIRES2-ZsGreen1/FⅨ的HEK-293细胞中可见绿色荧光散在分布（图2）。
图2. 激光共聚焦显微镜下观察pIRES2-ZsGreen1/FⅨ转染.
A：阴性对照（无转染的HEK293细胞）；B：转染pIRES2-ZsGreen1/FⅨ的HEK-293细胞
3．实时定量PCR检测FⅨ mRNA的表达：使用SYBRGreenl非探针法、比较Ct值（2−ΔΔCt）的相对定量方法对目的基因进行实时荧光定量检测，并结合PCR后的熔解曲线进行分析。以β-actin为内参基因，检测FⅨ在HEK-293细胞中的表达。目的基因与内参基因熔解曲线为特异单峰，无杂峰及特异性信号干扰，表明产物纯度高，具有良好的特异性。无转染的HEK-293细胞提取RNA为阴性对照，未检出FⅨ mRNA表达，提示HEK-293细胞本身不表达FⅨ mRNA。
4．细胞免疫荧光法检测FⅨ蛋白的表达：转染HEK-293细胞后，激光共聚焦显微镜下观察FⅨ蛋白表达。Dylight 649标记的羊抗鼠二抗显示为红色荧光，ZsGreen1显示为绿色荧光，DAPI显示为蓝色荧光。ZsGreen1蛋白绿色荧光与DAPI蓝色荧光基本重合，提示ZsGreen1蛋白定位于细胞核，而Dylight 649标记的红色荧光均匀分布于细胞核周围，提示FⅨ蛋白在细胞质中合成。转染pIRES2-ZsGreen1的HEK-293细胞为阴性对照，可见ZsGreen1蛋白绿色荧光与DAPI蓝色荧光表达，无Dylight 649标记的红色荧光表达，提示HEK-293细胞不表达FIX蛋白（图3）。
图3. 细胞免疫荧光法检测转染pIRES2-ZsGreen1/FⅨ质粒后HEK-293细胞凝血因子Ⅸ（FⅨ）的表达.
A：转染pIRES2-ZsGreen1 质粒（阴性对照）：激光共聚焦显微镜下可见ZsGreen1蛋白绿色荧光与DAPI蓝色荧光表达，无Dylight 649标记的红色荧光表达；B：转染pIRES2-ZsGreen1/FⅨ质粒：激光共聚焦显微镜下ZsGreen1蛋白绿色荧光与4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）蓝色荧光基本重合，提示ZsGreen1蛋白定位于细胞核，Dylight 649标记的红色荧光均匀分布于细胞核周围，提示FⅨ蛋白在细胞质中合成
5．一期法测定FⅨ∶C：野生型质粒pIRES2-ZsGreen1 /FⅨ转染细胞裂解液、细胞培养液的FⅨ∶C分别为（92.03±0.29）%、（86.89±8.78）%，而无转染的HEK-293细胞裂解液、培养液中FⅨ∶C均为0。提示pIRES2-ZsGreen1/FⅨ质粒成功转染HEK-293细胞并表达具有活性的FⅨ蛋白，HEK-293细胞不表达FⅨ蛋白。
讨论
FⅨ基因位于Xq26.3–27.2，全长34 kb，由8个外显子、7个内含子及侧翼顺序中的调控区域构成[3]。8个外显子长度25~1 933 bp，分别编码信号肽、前肽和羧基谷氨酸区（GLA区）结构域、类表皮生长因子结构域Ⅰ（EGF-1）、EGF-2、活化结构域及催化结构域[4]。FⅨ蛋白是由415个氨基酸残基组成的单链糖蛋白，含糖量约17%，包括GLA区、2个EGF区和催化区4个结构域[5]。
FⅨ基因缺陷主要包括点突变、基因缺失、异常基因插入、基因片段重排及影响mRNA剪接的突变等[6]。国际血友病B突变数据库（http://www.kcl.ac.uk/ip/petergreen/haemBdatabase.html/）共报道了1 000余种FⅨ基因突变，其中最常见的为点突变（约占90%），7％为小片段插入或缺失，3％为大片段插入或缺失。
目前，真核表达载体应用于外源基因的转导和表达往往是表达双基因载体，两个基因（1个目的基因和1个筛选基因）在不同的转录启动子下启动转录表达。常见的报告基因主要有β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酸酶、荧光虫荧光素酶等，但这些基因都需要底物和辅助因子，而且对细胞有一定的损伤[7]–[9]。理想的报告基因为无毒、高效表达的小分子蛋白，便于检测且不依赖底物和辅助因子[10]。
荧光蛋白珊瑚分离蛋白ZsGreen1是ZsGreen蛋白的衍生物，最大激发波长为493 nm，最大发射波长为505 nm，在肺部组织、肌肉组织及培养细胞中比EGFP、AcGFP、hMGFP等绿色荧光蛋白更亮，且8~12 h就可以观察荧光表达[11]。Ekberg等[12]报道，ZsGreen1在哺乳动物嗅觉系统中的活体和固定嗅觉神经细胞中高效表达，而且在多次扫描后荧光强度无明显衰减，提示ZsGreen1不仅能够用于蛋白定位，而且可作为稳定的活体标志物用于观察细胞的生长和运动。
目前，真核表达载体多表达融合蛋白，可影响目的蛋白的生物活性。含有内部核糖体结合位点（internal ribosome entrysite, IRES）的真核表达载体，使目的基因和报告基因共表达，经同一mRNA转录本分别翻译目的基因和报告基因使其高效表达，可方便地检测目的基因的表达水平和转染效率。IRES是指在真核细胞或病毒中表达的基因5′端具有一段较短的RNA序列（150~250 bp），能够折叠成类似于起始tRNA的结构，从而介导核糖体与RNA结合，启动蛋白质翻译。这个翻译机制不同于帽依赖翻译启动机制（cap-dependent translation initiation），与小核糖体扫描模型有别，这种非帽依赖翻译机制存在于绝大多数真核细胞和病毒mRNA的表达[13]–[15]。因此本研究选择含有IRES的pIRES2-ZsGreen1真核表达载体，使目的基因FⅨ和荧光蛋白珊瑚分离蛋白ZsGreen1共表达，此时荧光蛋白只作为目的蛋白转录和翻译的指示剂而不影响目的蛋白的功能。
本实验通过查找pcDNA/FⅨ质粒目的基因ORF区，利用Lasergene软件查找序列中的内切酶酶切位点，选择ORF区不存在但存在于pcDNA3.1质粒及pIRES2-ZsGreen1载体上的两个限制性内切酶EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ为酶切位点，对pIRES2-ZsGreen1进行双酶切。以pcDNA/FⅨ质粒为模板，在FⅨORF翻译起始位点及终止位点附近设计引物，扩增FⅨORF区，扩增产物进行胶回收后使用Infusion酶与线性pIRES2-ZsGreen1双酶切产物进行连接，连接产物进行转化后筛选阳性克隆，对阳性克隆进行DNA测序及凝胶电泳鉴定，成功构建野生型pIRES2-ZsGreen1/FⅨ，转染HEK-293细胞后，通过采用实时定量PCR检测FⅨ基因mRNA、细胞免疫荧光法检测FⅨ蛋白表达量及一期法检测检测细胞裂解液和细胞培养液中的FⅨ∶C，证实FⅨ野生型pIRES2-ZsGreen1真核表达载体构建成功。
Funding Statement
基金项目：国家自然科学基金（81270587）；山西省青年科技研究基金（2014021040-1）
Fund program: National Natural Science Foundation of China（81270587）; Shanxi Province Science Foundation for Youths（2014021040-1）
References
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