microRNA-202激活JNK/SAPK信号通路增强多发性骨髓瘤细胞药物敏感性的研究

Abstract

目的

研究microRNA-202（miR-202）对多发性骨髓瘤（MM）细胞生长的影响，并初步探讨miR-202在MM细胞药物敏感性中的作用机制。

方法

荧光定量PCR检测miR-202及其靶基因B淋巴细胞刺激因子（BAFF）在MM细胞中的表达水平。将miR-202模拟物、miR-202抑制物、BAFF干扰质粒（siBAFF）及其阴性对照转染U266细胞，Western blot检测Bcl-2家族和MAPK信号通路蛋白的表达。WST-1法、流式细胞术（Annexin V-FLUOS）分别检测转染后U266细胞的增殖和凋亡情况。

结果

U266细胞、MM患者CD138⁺细胞中miR-202 mRNA表达（分别为0.052±0.009、0.304±0.354）均低于健康对照组（3.550±1.126）（P<0.001，P=0.009），BAFF表达水平（5.700±0.734、9.576±2.887）均高于健康对照组（1.819±0.853）（P<0.001，P=0.006）。miR-202模拟物转染组细胞增殖抑制率高于对照组[（56.04±0.02）％对（18.89±0.32）%，P=0.002]。Western blot结果显示，转染miR-202模拟物后，U266细胞Bcl-2表达下调约24%，而Bax蛋白的表达上调约1.24倍，miR-202模拟物组细胞凋亡率高于对照组[（49.60 ± 4.89）％对（26.20 ± 1.28）%，P=0.029]。硼替佐米和miR-202模拟物联合组细胞凋亡率为（51.23 ± 5.41）%，高于硼替佐米单独处理组（31.70 ± 4.40）％和硼替佐米与模拟物对照联合处理组[（51.23±5.41）％对（31.70±4.40）%，P=0.047；（51.23±5.41）％对（27.94±4.04）%，P=0.028）]，而miR-202模拟物联合沙利度胺和地塞米松与miR-202模拟物对照组相比差异无统计学意义[（11.66±1.91）％对（10.63±1.74）%，P=0.700；（16.35±1.32）％对（17.43±1.95）%，P=0.400]。miR-202模拟物联合硼替佐米对U266细胞的增殖抑制率高于硼替佐米单独处理组[（36.93±5.98）%对（18.18±4.10）%，P=0.029]。miR-202模拟物及硼替佐米处理U266细胞后，p-JNK蛋白表达水平下调。

结论

miR-202模拟物和硼替佐米可协同抑制MM细胞增殖、诱导其凋亡，可能通过miR-202负向调控靶基因BAFF的表达、抑制JNK/SAPK信号通路的活化来实现的。

多发性骨髓瘤（MM）是一种目前仍不可治愈的浆细胞恶性肿瘤[1]–[2]。目前研究报道MM细胞的耐药机制主要包括NF-κB、JAK/Stat3、MEK/MAPK等信号通路的活化[3]。microRNA (miRNA）是一类包含21~25个核苷酸的小非编码RNA家族。近年来是肿瘤研究领域的研究热点，主要通过部分或完全互补至靶基因mRNA的3′ UTR，抑制或降解靶基因mRNA，从而在转录后水平调节基因表达[4]。miRNA除了在正常生理过程中发挥作用，还参与许多疾病的发生发展[5]–[6]。通过基因芯片技术在MM患者样本和细胞株发现了miR-181、miR-21、miR-17-92、miR-202和miR-9等许多miRNA分子。我们前期研究发现MM患者外周血单个核细胞中表达miR-202及其靶基因B淋巴细胞刺激因子（BAFF），但是两者的功能及相互作用尚不清楚[7]–[8]。Gao等[9]研究发现miRNA能调节白血病细胞株对药物的敏感性和耐药性。本研究旨在观察miR-202联合硼替佐米、沙利度胺和地塞米松对MM细胞增殖及凋亡的影响并探讨MAPK信号通路在miR-202调节MM细胞耐药中的作用。

材料与方法

1．主要试剂：Bax、Bcl-2、β-Actin抗体购自上海碧云天生物技术有限公司南通分公司；c-Jun氨基末端激酶（JNK）、磷酸化c-Jun氨基末端激酶（p-JNK）、p38、p-p38、细胞外调节蛋白激酶（ERK）、磷酸化细胞外调节蛋白激酶（p-ERK）抗体为美国Cell Signaling公司产品；Annexin V-FLUOS Staining kit、Cell Proliferation Reagent WST-1为德国Roche公司产品；lipo2000、逆转录试剂为立陶宛Fermentas公司产品；FBS为美国Hyclone公司产品；RPMI1640培养基、Opti-MEM Reduced Serum Medium为美国Gibco公司产品；B淋巴细胞刺激因子干扰质粒（siBAFF，BAFF-homo-708）为上海吉玛制药技术有限公司产品；TRIzol、has-miR-202模拟物、has-miR-202抑制物、阴性对照、抑制物阴性对照为Invitrogen公司产品。

2．样本来源及细胞培养：骨髓标本来自2013年9月至2014年12月南通大学附属医院就诊的7例初诊MM患者[男4例，女3例，中位年龄60 (50~65）岁]和3名志愿者[男2名，女1名，中位年龄54 (48~60）岁]。本研究经南通大学附属医院伦理委员会批准，所有受试者均知情同意。人MM细胞系U266细胞购于上海拜力生物科技有限公司，悬浮生长于含10％胎牛血清、1％链霉素-青霉素、1％谷氨酰胺的RPMI 1640培养基中，置于37 °C、含5%CO₂的培养箱中进行培养。

3．细胞转染：收集对数生长期细胞，按每孔（2~8）×10⁵的密度接种于6孔板，6 h后分别将miR-202模拟物（5′-AGAGGUAUAGGGCAUGGGAA-3′、5′-CCCAUGCCCUAUACCUCUUU-3′）、阴性对照（5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′、5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′）、miR-202抑制物（5′-UUCCCAUGCCCUAUACCUCU-3′）、siBAFF（5′-CAUGGCUUCUCAGCUUUAATT-3′、5′-UUAAA GCUGAGAAGCCAUGTT-3′）转染入U266细胞中，培养48~72 h后分别提取总RNA和蛋白。

4．逆转录PCR将U266细胞及MM患者CD138⁺浆细胞中RNA逆转录成cDNA：TRIzol法提取细胞总RNA，用紫外分光光度计测得总RNA浓度，取5 µg RNA进行逆转录。反应条件：42 °C 60 min，70 °C 5 min。逆转录产物于−20 °C保存。

5．荧光定量PCR检测U266细胞及MM患者CD138⁺浆细胞miR-202及BAFF mRNA的表达水平：BAFF引物序列：5′-TGTCACCGCGGGACTGAAAATCT-3′（上游引物），5′-TGTCTGCAATCAGTTGCAAGCAGT-3′（下游引物），以GAPDH和U6作为内参基因。miR-202引物购自广州锐博生物科技有限公司。反应体系：SYBR GreenⅠmix（Rox）10 µl，cDNA 3 µl，上、下游引物各0.5 µl，RNase-free水补足至20 µl。反应条件：95 °C 10 min; 95 °C 15 s, 60 °C 15 s, 72 °C 31 s, 40个循环。

6．Western blot检测U266细胞转染miR-202模拟物、抑制物、siBAFF及其对照后凋亡相关蛋白及MAPK信号通路中蛋白表达水平：用RIPA裂解液（含1%PMSF）提取细胞总蛋白，紫外分光光度计检测蛋白浓度，取400 µg总蛋白进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（80 V 40 min, 100 V 60 min），并将蛋白从SDS-PAGE凝胶转至PVDF膜（300 mA 120 min）。50 g/L脱脂奶粉/TBST液封闭2 h。按1∶600稀释一抗（Bcl-2、Bax、JNK、p-JNK、p38、p-p38、ERK、p-ERK），按1∶1 000稀释β-actin抗体，4 °C孵育过夜。按1∶1 000稀释二抗（山羊抗兔IgG、山羊抗鼠IgG），室温孵育2 h，用增强化学发光液进行显影。

7．WST-1细胞增殖检测：收集对数生长期U266细胞，按3 000细胞／孔的密度种入96孔板，6 h后转染miR-202模拟物、miR-202抑制物、siBAFF及其对照，培养基补足至每孔100 µl，24~72 h后每孔加入10 µl WST-1试剂，继续培养2 h后，用酶标仪测量各孔450 nm（650 nm参考）的吸光度（A）值。每组设5个复孔，实验重复3次，结果取均数。按以下公式计算细胞增殖抑制率。

$$细胞增殖抑制率(\%)=1-(\frac{A_{目的孔}}{A_{空白对照孔}})\times 100\%$$

8．流式细胞术（Annexin V-FLUOS）检测细胞凋亡：细胞种板，6 h后转染miR-202模拟物及其对照，48 h后收集6孔板内细胞，移入2 ml EP管中，离心后1×PBS洗涤2次，按试剂盒说明书配制细胞染液，室温孵育10~15 min，混匀进行流式细胞术检测。实验重复3次，结果取均数。此外，用50 nmol/L硼替佐米、200 µmol/L沙利度胺、10 nmol/L地塞米松单药及联合50 nmol/L miR-202模拟物作用于U266细胞，采用上述方法检测细胞凋亡率。

9．统计学处理：应用SPSS 17.0软件进行分析。实验数据以x±s表示，两组比较采用Mann-Whitney U检验，P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1．U266细胞及MM患者CD138 ⁺浆细胞miR-202 mRNA及BAFF的表达：流式细胞术分选MM患者及健康人骨髓来源CD138⁺浆细胞。提取U266细胞株及CD138⁺浆细胞的总RNA进行逆转录及荧光定量PCR。U266细胞、MM患者CD138⁺浆细胞miR-202 mRNA相对表达量分别为0.052± 0.009、0.304 ± 0.354，均低于健康对照组（3.550 ± 1.126）（P<0.001，P=0.009）。通过检索microRNA. org与DIANA-miT生物信息学工具预测发现B淋巴细胞刺激因子（BAFF）是miR-202潜在的靶基因，荧光素酶报告基因进一步证实两者之间的调控关系[8]。实时荧光定量PCR检测结果显示U266细胞、MM患者CD138⁺浆细胞BAFF表达分别为5.700± 0.734、9.576 ± 2.887，均高于健康对照组（1.819 ± 0.853）（P<0.001，P=0.006）。

2．miR-202对U266细胞生长和凋亡的影响：U266细胞转染miR-202模拟物（mimics）、miR-202抑制物（Inhibitor）、siBAFF及其对照。WST-1实验发现miR-202模拟物转染组细胞增殖抑制率为（56.04±0.02）%，与对照组[（18.89±0.32）%]相比，差异有统计学意义（P=0.002），提示miR-202可通过靶向BAFF抑制U266细胞增殖。Western blot结果显示，转染miR-202模拟物后，Bcl-2表达下调约24%，Bax蛋白表达上调约1.24倍（图1），提示miR-202能够诱导U266细胞凋亡。此外，流式细胞术结果显示，miR-202模拟物组细胞凋亡率高于对照组[（49.60 ± 4.89）％对（26.20 ± 1.28）％，P＝0.029]，siBAFF组、miR-202抑制物组细胞凋亡率分别为（30.70±1.44）%、（40.40±1.34）%，与对照组相比差异无统计学意义（P值分别为0.200、0.310）（图2），提示miR-202模拟物抑制U266细胞增殖、促进细胞凋亡。

图1. Western blot法检测转染miR-202模拟物对U266细胞凋亡相关蛋白表达的影响.

1：对照组；2：miR-202模拟物；3：miR-202抑制物；4：BAFF干扰质粒（siBAFF）

图2. 流式细胞术检测miR-202对U266细胞凋亡的影响.

1：对照组；2：miR-202模拟物；3：miR-202抑制物；4：BAFF干扰质粒（siBAFF）

3．流式细胞术检测miR-202、硼替佐米、沙利度胺、地塞米松对U266细胞凋亡的影响：为了研究miR-202在抗骨髓瘤药物诱导的MM细胞凋亡中作用，我们单独使用miR-202模拟物或抗骨髓瘤药物以及两者联合处理U266细胞后，用流式细胞术检测细胞凋亡情况。如图3所示，硼替佐米和miR-202模拟物联合组凋亡率[（51.23±5.41）%]高于硼替佐米单独处理组[（31.70±4.40）%，P=0.047]和硼替佐米与模拟物对照联合处理组[（27.94 ± 4.04）%，P= 0.028]。然而，模拟物对照组与miR-202模拟物联合沙利度胺、地塞米松组的细胞凋亡率差异无统计学意义[（11.66±1.91）％对（10.63±1.74）%，P=0.700；（16.35 ± 1.32）％对（17.43 ± 1.95）%，P=0.400]，提示miR-202模拟物增加了U266细胞对硼替佐米的敏感性，也就是说MM中miR-202的低表达与MM对硼替佐米的耐药相关。

图3. 流式细胞术分析miR-202与抗多发性骨髓瘤药物对U266细胞凋亡的影响.

A：未转染；B：转染miR-202对照；C：转染miR-202模拟物

4．miR-202模拟物对U266细胞药物敏感性的影响：硼替佐米、miR-202模拟物对U266细胞增殖抑制率分别为（18.18±4.10）%、（15.38±1.90）%，两者联合的抑制率为（36.93±5.98）%，与单独使用硼替佐米相比差异有统计学意义（P=0.029）。单独用地塞米松、miR-202模拟物对U266细胞增殖抑制率分别是（17.47±4.92）%、（15.50±2.31）%，两者联合的抑制率为（26.67±2.89）%，与单独使用地塞米松相比差异无统计学意义（P=0.100）。沙利度胺单独、联合miR-202对U266细胞增殖抑制率差异无统计学意义[（15.68±2.27）％对（20.55±4.90）%，P=0.200]。以上结果提示miR-202表达的上调使U266细胞对硼替佐米更敏感。

5．Western blot检测miR-202对MAPK信号通路的影响：U266细胞中有ERK、p38、JNK和p-JNK表达，未检测到p-ERK和p-p38表达且miR-202模拟物组p-JNK表达水平下调约20%（图4），表明JNK/SAPK信号通路参与了miR-202的表达调控。我们进一步检测了硼替佐米处理48 h后U266细胞p-JNK的表达水平。结果显示与对照组相比，miR-202模拟物组和siRNA-BAFF组的p-JNK表达水平分别下调52%、67%（图5），表明miR-202模拟物与siRNA-BAFF有类似的作用。这些结果提示miR-202能够负向调控BAFF的表达，进一步抑制JNK/SAPK信号通路的活化，从而增强了MM细胞对硼替佐米敏感性。

图4. Western blot检测miR-202对MAPK信号通路的影响.

1：BAFF干扰质粒；2：抑制物；3：抑制物阴性对照；4：模拟物；5：模拟物阴性对照；6：对照组

图5. Western blot分析经硼替佐米处理48 h后U266细胞p-JNK水平.

1：对照组；2：miR-202模拟物；3：BAFF干扰质粒对照；4：BAFF干扰质粒

讨论

MM是一种克隆B细胞恶性疾病，以骨髓中浆细胞异常和不可控制的增殖、骨损伤和免疫缺陷为特征。浆细胞的恶性增殖产生大量无功能的单克隆免疫球蛋白或片段，临床表现为贫血、肾损伤、骨损伤和感染。目前，MM患者由于耐药的产生而缺乏有效的治愈方案[10]。

BAFF通过连接受体B细胞成熟抗原（BCMA）、转膜蛋白复合物（TACI）和BAFF受体（BAFF-R/BR3）在调节B细胞和T细胞增殖与生存中发挥重要作用。越来越多的证据显示BAFF影响恶性B细胞的生长和生存，促进MM细胞增殖和生存，与MM发展和进程密切相关[11]。我们的前期研究表明MM患者外周血及MM细胞株中BAFF及其受体的表达显著高于正常对照组[12]–[13]，提示BAFF在MM起始和进展中发挥重要作用。近来有研究表明BAFF参与MM耐药的发生[14]。然而，BAFF在MM发病机理和耐药中的生物学作用并不十分清楚。

前期研究发现MM患者血清miR-202表达水平显著升高，且与血清β₂微球蛋白和κ链浓度有一定相关性[15]。本研究中MM患者CD138⁺细胞和U266细胞株中miR-202 mRNA低表达，与前期研究相反，可能由于骨髓基质细胞（BMSC）分泌高水平BAFF[16]，具体机制仍需进一步研究。

尽管MM患者对硼替佐米最初反应总体很好，但随着时间的推移许多患者会产生耐药，MM患者对硼替佐米药物敏感性和耐药性的准确调节机制仍未阐明[17]。本研究的结果提示，miR-202模拟物使U266细胞对硼替佐米敏感且联合miR-202模拟物对MM细胞生存的抑制作用更为显著。这些结果提示miR-202表达的调节机制可能是MM治疗的一个潜在靶点。

许多研究表明不同的药物通过改变MAPK信号通路的活化发挥其抑制MM细胞增殖和生存的能力[18]–[19]。我们在前期研究中发现BAFF能激活JNK/SAPK信号通路、BAFF siRNA抑制JNK/SAPK信号通路，提示JNK/SAPK信号通路的活化程度与BAFF表达水平呈正相关[19]。本研究中我们发现U266细胞转染miR-202模拟物后MAPK信号通路中p-JNK表达下调，提示miR-202抑制JNK/SAPK信号通路，且JNK/SAPK信号通路参与miR-202对BAFF的调控。同时对硼替佐米治疗反应性的提高可能由于miR-202对BAFF介导的信号通路的抑制作用，进而阻碍JNK/SAPK信号通路的再活化，提示miR-202靶向BAFF可能为MM患者的治疗提供新的选择。

Funding Statement

基金项目：国家自然科学基金面上项目（81271920、81301498）；江苏省重点研发专项（BE2015654）；江苏省卫计委科研课题（H201422、H201526）

Fund program: National Natural Science Foundation of China（81301498, 81271920）; Key Project of Jiangsu Province（BE2015654）; Scientific Research Foundation for Jiangsu Provincial Commission of Health and Family Planning（H201422, H201526）