Abstract
目的
探讨伴AML1-ETO融合基因的急性髓系白血病（AML）患者ASXL2基因突变情况、突变阳性患者临床特征及ASXL2基因突变与c-kit基因突变的关系。
方法
采用PCR扩增产物片段直接测序分析法，检测59例伴AML1-ETO融合基因初发AML患者ASXL2基因第11、12外显子编码区突变情况，比较ASXL2基因突变阳性和阴性组患者的临床特征、生存及c-kit基因突变情况。
结果
59例患者中7例存在ASXL2突变，突变率为11.9%。ASXL2基因突变阳性组患者初诊时外周血红蛋白浓度中位数为56.2（38.0~72.0）g/L，显著低于ASXL2突变阴性组患者的69.0（37.2~154.0）g/L，差异有统计学意义（P=0.038）；外周血WBC、PLT、嗜酸粒细胞比例、骨髓原始细胞比例与ASXL2突变阴性组相比，差异均无统计学意义（P值均>0.05）。两组均未见肝、脾、中枢神经系统浸润；淋巴结不同程度肿大，但ASXL2基因突变阳性、阴性两组间差异无统计学意义（P=0.859）。免疫表型分析显示：ASXL2基因突变阳性组CD33表达显著低于阴性组（P=0.033）；两组患者均未表达cCD3，CD117、cMPO、HLA-DR、CD34、CD38、CD13、CD44、CD15、CD64、CD11b、CD56、CD19、cCD79a、CD7两组表达差异均无统计学意义（P值均>0.05）。ASXL2基因突变阳性与阴性组患者总缓解率、总生存时间差异均无统计学意义（P值分别为0.577、0.631）。两组c-kit基因突变检出率分别为14.3％和29.4%，差异无统计学意义（P=0.697）。
结论
该组伴AML1-ETO融合基因AML患者ASXL2基因突变率为11.9%。ASXL2突变阳性患者外周血红蛋白浓度、CD33表达方面呈现一定的临床特征。ASXL2基因突变与c-kit基因变突可能没有特定的关联性。
Keywords: 白血病，髓样，急性, 基因，ASXL2, DNA突变分析
Abstract
Objective
To investigate frequency and clinical features of additional sex combs-like 2 (ASXL2) gene mutation in acute myeloid leukemia (AML) patients with AML1-ETO fusion gene and to analyze the relationship between ASXL2 gene mutation and c-kit gene mutation.
Methods
Mutation analysis of exon 11 and 12 of ASXL2 gene in 59 de novo AML patients was performed by using polymerase chain reaction (PCR) followed by sequence analysis. The clinical features, survival curve and c-kit gene mutation in ASXL2 gene mutation positive and negative patients were compared.
Results
In a total of 59 AML patients with AML1-ETO fusion gene positive, 11.9% (7/59) patients harboured ASXL2 gene mutations. The hemoglobin levels of patients with mutated ASXL2 gene [56.2 (38.0–72.0) g/L] were significantly lower than those with wild type ASXL2 [69.0(37.2–154.0) g/L] (P=0.038). Differences were not observed in white blood cell counts, platelet counts, the proportion of acidophilic cell, and the proportion of primitive cell in the marrow between patients with mutant ASXL2 and ones without mutant ASXL2 (P>0.05). None of all 59 patients suffered from liver, spleen, central nervous system metastases in both groups. Moreover, enlarged lymph nodes was similar between patients with mutant ASXL2 and ones without mutant ASXL2 (P=0.859). Immunophenotypic analysis: in positive group CD33 positive expression was significantly lower than that of negative group (P=0.033). cCD3 was not expressed in both groups. Expression levels of CD117, cMPO, HLA-DR, CD34, CD38, CD13, CD44, CD15, CD64, CD11b, CD56, CD19, cCD79a and CD7 were similar between patients with mutant ASXL2 and ones without mutant ASXL2 (P>0.05). All of 59 patients were in remission (P=0.577). Overall survival was similar between patients with mutant ASXL2 and ones without mutant ASXL2 (P=0.631). The mutation rates of c-kit in positive group and negative group were 14.3% and 29.4%, without statistical significance (P= 0.697).
Conclusion
ASXL2 mutation may be a new event that can cooperate with AML1-ETO to induce leukemia. Patients in AML1-ETO positive AML with ASXL2 mutation show specific clinical characteristics of hemoglobin levels and expression level of CD33. ASXL2 gene mutations and c-kit gene mutations may not have a specific correlation between them.
Keywords: Leukemia, myeloid, acute; Gene, ASXL2; DNA mutation
人类ASXL2基因属于ASXL基因家族（同源基因包括ASXL1、ASXL3）[1]–[6]，定位于染色体2p23.3，长144 722 bp，包含12个外显子，编码长为1 435个氨基酸的核蛋白，是表观调节蛋白polycomb家族（polycomb group，PcG）和trithorax家族（trithorax group, TrxG）的增强子，发挥转录抑制和激活的双重调节功能[1],[3],[5]–[8]。生理情况下高表达于心脏、中轴骨、大脑皮层、视网膜等组织[8]。近期Micol等[9]及Metzeler[10]对ASXL2基因突变进行研究，发现该突变特异性存在于AML1-ETO融合基因阳性的患者，并且主要发生在第11、12外显子区，以移码突变和点突变为主要突变类型，发生该突变的患者疾病3年累计复发率较未突变者增高。我们采用PCR扩增产物片段直接测序分析法对59例伴AML1-ETO融合基因的初发急性髓系白血病（AML）患者进行了ASXL2基因突变的检测，初步探讨ASXL2基因在中国汉族人群的突变发生情况及其临床意义。
病例与方法
一、病例
59例2010年10月至2015年10月在我院就诊的初诊伴AML1-ETO融合基因的AML患者纳入研究，其中男32例，女27例。中位年龄38 (5~77）岁，诊断均符合文献[11]标准。FAB分型：M1 1例（1.7%），M2 52例（88.1 %），M4 4例（6.8%），特殊M2合并M31例（1.7%），未知1例（1.7%）。本研究经我院伦理委员会批准，获得患者知情同意。
二、ASXL2和c-kit基因突变检测
1．样品制备：取59例AML患者骨髓，用DNA提取试剂盒（美国OMEGA公司产品）抽提基因组DNA。样本不足的选取骨髓涂片用Chelex 100法提取基因组DNA。紫外分光光度计检测其浓度和纯度，符合要求（A260 /A280≥1.7）的标本4 °C保存待用。
2．ASXL2基因的PCR扩增：ASXL2基因第11、12外显子PCR扩增所用的5对引物由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成，引物序列用primer premier 5.0软件设计（表1）。PCR体系50 µl：PCR缓冲液41 µl、上下游引物（20 µmol/L）各1 µl、TaqDNA聚合酶3 µl、DNA 4 µl。PCR热循环条件：95 °C预变性2 min，95 °C变性30 s, 58 °C退火30 s，72 °C延伸4 min，循环35次，72 °C再延伸10 min。扩增反应在T100™Thermal Cycler扩增仪（美国BIO-RAD公司产品）中进行。以待测者的DNA为模板，分别用以上5对引物进行扩增，可以得到5段扩增产物覆盖ASXL2第11、12外显子区，扩增产物用于测序分析。测序由北京华大基因科技服务有限公司完成，测序结果与美国国家生物技术信息中心（NCBI）基因库序列进行比对，基因序列号：GeneBank DNA NC_000002。
表1. 各种扩增基因PCR引物序列.
| 基因 | 引物序列（5′→3′） | 产物长度（bp） |
| ASXL2-11E | F：CTTTCGCAACATGGGCTATT | 948 |
| R：GCAGTTCTAAATGCCCATCTATC | ||
| ASXL2-12E-1 | F：AAAAGTGGATGCAAGGACCCTA | 971 |
| R：AGCCACTGGCACACTAGCATC | ||
| ASXL2-12E-2 | F：CATCACCAGCCCACATAGAGAA | 823 |
| R：AGGATCTGATCTTGGGTTGCTT | ||
| ASXL2-12E-3 | F：CGGTTCCACTGACTGCAAAAG | 918 |
| R：TGCTACGGATTGCCTTACCTC | ||
| ASXL2-12E-4 | F：CAAGGGTGACACAAGTTCAGGAC | 773 |
| R：GTGATTCCAAAAGGACGCAAAA | ||
| c-kit17E | F：ATGTGAACATCATTCAAGGCGTACT | 422 |
| R：GCTAAAATGTGTGATATCCCTAGACAG | ||
| c-kit8-11E | F：CTCAGGAAGGTTGTAGGGATTAGAGAGGGAGTG | 4 233 |
| R：TGTTGTCCAGAGACATTTTCCTACGATGTTCTC | ||
| 中间测通引物1 | F：TCATCAGGATTCAAACCCGC | |
| 中间测通引物2 | F：CATGGGCTGTGAGTTGGGAG |
注：E：外显子；F：正向引物；R：反向引物
3．c-kit基因的PCR扩增：c-kit基因第17、8~11外显子引物设计如表1。第17外显子PCR体系同上。PCR热循环条件：95 °C预变性3 min, 95 °C变性30 s, 60 °C退火30 s, 72 °C延伸45 s，循环35次，72 °C再延伸10 min。第8~11外显子PCR体系：2×GC缓冲液Ⅰ25 µl、dNTP Mixture 8 µl、上下游引物各1 µl、LA Taq酶0.5 µl、DNA 2.0 µl，双蒸水补充至50 µl。PCR热循环条件（两步扩增法）：95 °C预变性3 min，95 °C变性30 s, 68 °C退火4 min，循环35次，68 °C再延伸10 min。测序方法同上，基因序列号：GeneBank DNA NC_ 000004。
三、统计学处理
计量资料若服从正态分布，比较用Student's t检验，用均数±标准差描述；反之用非参数检验，用M（范围）描述。计数资料比较用χ2检验、Fisher确切概率法。生存率的估计用Kaplan-Meier法，生存曲线比较用对数秩检验。P<0.05为差异有统计学意义。所有数据用SPSS17.0软件进行分析处理。
结果
1．ASXL2基因突变分析：59例伴AML1-ETO融合基因的初发AML患者，检出7例存在ASXL2突变，突变率为11.9%。7个突变包括1个（14.3%）点突变和6个（85.7%）移码突变，分布在第11、12外显子。第11外显子存在3个突变类型：1247–1248位插入2个碱基AG（c.1247–1248 insAG），使417位丙氨酸突变为精氨酸，框移7个氨基酸（p.A417RfsX7）（图1A）；1255–1256位缺失2个碱基TT（c.1255 –1256 delTT），使419位亮氨酸突变为组氨酸，框移13个氨基酸（p.L419HfsX13）（图1B）；1643位G突变为A的杂合突变（c.1643G>A），使548位谷氨酸同义突变为谷氨酸（p.E548E）（图1C）。第12外显子存在4个突变类型：1970–1971位插入4个碱基GGAA（c.1970–1971insGGAA），使658位丙氨酸突变为甘氨酸，框移50个氨基酸（p.A658GfsX50）（图1D）；2084–2085位插入1个碱基G（c.2084–2085insG），使698位甘氨酸突变为色氨酸，框移9个氨基酸（p.G698WfsX9）（图1E）；2218位缺失1个碱基C同时插入2个碱基GG（c.2218delCinsGG），使740位苏氨酸突变为精氨酸，框移16个氨基酸（p.T740RfsX16）（图1F）；2243位缺失1个碱基A同时插入10个碱基GTAAGGCACC（c.2243delAins GTAAGGCACC），使749位谷氨酸突变为终止密码子（p.E749X）（图1G）。
图1. 伴AML1-ETO融合基因的急性髓系白血病患者ASXL2基因突变测序图.
A、B、C分别为ASXL2基因第11外显子PCR产物直接测序结果。A：c.1247–1248insAG（p.A417RfsX7）；B：c.1255–1256delTT（p.L419HfsX13）；C：c.1643G>A（p.E548E）。D、E、F、G分别为ASXL2基因第12外显子PCR产物直接测序结果。D：c.1970–1971insGGAA（p.A658GfsX50）；E：c.2084–2085insG（p.G698WfsX9）；F：c.2218delCinsGG（p.T740RfsX16）；G：c.2243delAins GTAAGGCACC（p.E749X）（箭头所示为突变位点）
2．ASXL2基因突变患者的临床特征分析：7例ASXL2基因突变阳性患者中男6例，女1例，中位年龄37(17~46）岁；52例阴性患者中男26例，女26例，中位年龄38.5(5~77）岁。ASXL2基因突变阳性、阴性组患者性别及年龄差异均无统计学意义（P值均>0.05）（表2）。
表2. 59例伴AML1-ETO融合基因的急性髓系白血病患者中ASXL2基因突变阳性、阴性组的临床特征比较.
| 临床特征 | 阳性组（7例） | 阴性组（52例） | P值 |
| 年龄[岁，M（范围）] | 37（17~46） | 38.5（5~77） | 0.411 |
| 性别[例（%）] | 0.507 | ||
| 男 | 6（85.7） | 26（50.0） | |
| 女 | 1（14.3） | 26（50.0） | |
| WBC[×109/L，M（范围）] | 28.2（1.2~124.0） | 8.7（0.9~50.4） | 0.386 |
| HGB[g/L，M（范围）] | 56.2（38.0~72.0） | 69.0（37.2~154.0） | 0.038 |
| PLT[×109/L，M（范围）] | 16.0（2.3~44.8） | 26.8（7.0~415.0） | 0.205 |
| 嗜酸粒细胞比例[M（范围）] | 0.000 5（0~0.128） | 0.001（0~0.056） | 0.698 |
| 原始细胞比例[M（范围）]a | 0.540（0.040~0.635） | 0.525（0.010~0.910） | 0.346 |
| 髓外浸润[例（%）]b | |||
| 肝 | 0 | 0 | |
| 脾 | 0 | 0 | |
| 淋巴结 | 2（28.6） | 9（17.6） | 0.859 |
| 中枢神经系统浸润 | 0 | 0 | |
| 治疗缓解[例（%）]b | 7（100.0） | 43（84.3） | 0.577 |
| 总体生存时间[月，M（范围）] | 8（6~28） | 22（0~54） | 0.631 |
| 白细胞分化抗原[例（%）]c | |||
| CD117 | 4（66.7） | 43（95.6） | 0.063 |
| cMPO | 6（100.0） | 44（97.8） | 1.000 |
| HLA-DR | 4（66.7） | 28（62.2） | 1.000 |
| CD34 | 6（100.0） | 42（93.3） | 1.000 |
| CD38 | 6（100.0） | 43（95.6） | 1.000 |
| CD13 | 5（83.3） | 40（88.9） | 0.548 |
| CD14 | 1（16.7） | 2（4.4） | 0.319 |
| CD15 | 4（66.7） | 30（66.7） | 1.000 |
| CD33 | 4（66.7） | 44（97.8） | 0.033 |
| CD64 | 3（50.0） | 21（46.7） | 1.000 |
| CD11b | 1（16.7） | 12（26.7） | 0.977 |
| CD56 | 4（66.7） | 34（75.6） | 1.000 |
| CD19 | 4（66.7） | 29（64.4） | 1.000 |
| cCD79a | 1（16.7） | 2（4.4） | 0.319 |
| cCD3 | 0 | 0 | |
| CD7 | 1（16.7） | 1（2.2） | 0.224 |
注：a：实际统计例数为56例（ASXL2基因突变阳性组7例、阴性组49例）；b：实际统计例数为58例（ASXL2基因突变阳性组7例、阴性组51例）；c：实际统计例数为51例（ASXL2基因突变阳性组6例、阴性组45例）。治疗缓解：部分缓解＋完全缓解
ASXL2基因突变阳性组患者初诊时HGB显著低于阴性组患者，差异有统计学意义（P=0.038）；外周血WBC、PLT、嗜酸粒细胞比例、骨髓原始细胞比例与ASXL2基因突变阴性组相比，差异均无统计学意义（P值均>0.05）（表2）。
两组患者均未见肝、脾、中枢神经系统浸润；淋巴结不同程度肿大，但ASXL2基因突变阳性、阴性两组间差异无统计学意义（P=0.859）。免疫表型分析显示：阳性组CD33表达显著低于阴性组（P= 0.033）；cCD3两组患者均未表达，CD117、cMPO、HLA-DR、CD34、CD38、CD13、CD44、CD15、CD64、CD11b、CD56、CD19、cCD79a、CD7两组表达差异均无统计学意义（P值均>0.05）。ASXL2基因突变阳性与阴性组患者总缓解率差异无统计学意义（P= 0.577）（表2）。ASXL2基因突变阳性组患者中位生存时间为8(6~28）个月，低于阴性组患者的22(0~54）个月，但两组间差异无统计学意义（P= 0.631）（图2）。
图2. ASXL2基因突变对伴AML1-ETO融合基因的急性髓系白血病患者总生存率的影响.
3．ASXL2基因突变与c-kit基因突变关系分析：58例伴AML1-ETO融合基因的AML患者，检出16例存在c-kit基因变突，突变率为27.6%，突变类型：D419FfsX561（c.1254–1255insTTTTTC）、T417Sf sX561（c.1248–1256delGACTTACGAinsATC）、M541L(c.1621A>C）、A814A(c.2442C>T）、D816Y/H（c.2446G>T/C）、D816V（c.2447A>T）、D820Y（c.2458 G>T）、N822K（c.2466T>G/A）、Y823D(c.2467T>G）。7例ASXL2基因突变阳性AML患者中1例（14.3%）发生c-kit突变，51例ASXL2基因突变阴性患者中15例（29.4%）发生c-kit突变，两组差异无统计学意义（P=0.697）。
讨论
研究证实AML1-ETO融合基因形成的融合蛋白不能够单独导致白血病的发生，可能还存在其他突变分子协同AML1-ETO融合蛋白共同致白血病发生[12]–[13]。研究人员已经在AML1-ETO融合基因阳性患者中发现了c-kit、FLT3、N/KRAS、ASXL1基因突变，这些突变分子可能是AML1-ETO融合基因阳性患者发病主要的“协同分子”。2014年，Micol等[9]首次报道在伴AML1-ETO融合基因的AML患者中约22.7％存在ASXL2基因突变，提示ASXL2突变可能是伴AML1-ETO融合基因AML患者除c-kit、ASXL1、FLT3、KRAS、NRAS突变外一种新的“协同分子”，目前还没有ASXL2突变在亚洲AML患者中发生情况的研究。我们对59例伴AML1-ETO融合基因初发AML患者ASXL2突变情况进行了检测，我们的结果与Micol等的报道有所差别，在59例伴AML1-ETO融合基因AML患者中检出突变患者7例，突变率为11.9%，低于国外的报道（22.7%）[4],[9]–[10]；7例突变患者中，1例患者突变（c.1247–1248insAG: p.A417RfsX7）与国外报道相同，1例患者突变点（c.2218 delCAinsGG: p.T740R fsX16）位于已报道的ASXL2突变热点区，其他5例患者突变类型为新发现突变位点且散在分布于ASXL2的第11、12外显子区。
Micol小组发现ASXL2基因突变阳性组具有外周血白细胞水平增高的特点[9]，我们的结果与之不同，ASXL2基因突变阳性组外周血WBC与阴性组相比较差异无统计学意义。我们比较了两组患者初诊时血红蛋白、血小板计数、外周血嗜酸粒细胞比例、骨髓原始细胞比例，发现阳性组血红蛋白水平比阴性组明显降低，而后三者差异均无统计学意义，这种情况可能与东西方种族差异有关。我们还对两组间的白细胞分化抗原的表达情况进行比较分析，发现T系分化抗原标志cCD3在两组患者中均未表达，这可能是AML1-ETO阳性AML的免疫学特征；CD33在ASXL2突变阳性组中的表达与阴性组相比显著降低（P=0.033），表明ASXL2突变与CD33表达可能存在某种程度的关联性。治疗方面我们统计到51例ASXL2突变阴性AML患者治疗缓解43例（84.3%），7例ASXL2突变阳性患者全部缓解，两组差异无统计学意义（P=0.577），ASXL2突变可能对患者治疗反应方面的影响不大。ASXL2突变阳性和阴性患者组中位生存时间分别为8和22个月，差异无统计学意义（P=0.631），该结果可能由ASXL2基因突变阳性患者组样本量少引起。
Micol小组发现ASXL2基因突变阳性组中部分患者同时存在c-kit基因变突[9]–[10]，我们的结果与之类似，7例ASXL2突变阳性患者中1例（14.3%）发生c-kit突变。但我们同时发现在51例ASXL2突变阴性患者中有15例（29.4%）也检出c-kit突变，且ASXL2突变与c-kit突变没有特定的关联性（P= 0.697），为探寻两者间及与AML1-ETO融合基因的关系，尚需进一步扩大样本量来深入探讨。
Funding Statement
基金项目：国家自然科学基金（81241014、81500104）；山西省回国留学人员重点科研资助项目（2015-重点5）；山西医科大学科技创新基金（01201413）
Fund program: National Natural Science Foundation of China（81241014, 81500104）; Key Project of Overseas Returnee Research of Shanxi Province（2015-key 5）; Science and Technology Innovation Project in Shanxi Medical University（01201413）
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