提高非体外去除T细胞单倍型相合造血干细胞移植疗效的策略

目前，对于缺乏人类白细胞抗原（HLA）相合同胞供者的恶性血液病患者而言，单倍型相合供者已成为一个重要的供者来源[1]–[4]。国内外的单倍型相合造血干细胞移植（Haploidentical stem cell transplantation, Haplo-HSCT）主要分为体外去除T细胞（T cell depletion, TCD）和非体外去除T细胞（T cell replete, TCR）两种模式[5]–[18]，前者包括意大利佩鲁贾团队建立的CD34阳性分选的TCD方案和德国图宾根大学团队建立的阴性选择去除TcRαβ/CD19细胞的方案；后者包括北京大学团队基于G-CSF和抗胸腺细胞球蛋白（ATG）诱导免疫耐受建立的非体外去除T细胞的单倍型相合骨髓和外周血混合移植体系（被国际学者称为“北京方案”）[1]–[2],[5],[19]及约翰霍普金斯大学建立的移植后应用环磷酰胺（Post cyclophosphamide, PT/Cy）诱导免疫耐受的Haplo-HSCT方案（被称为“巴尔的摩方案”）[13]–[14]（表1）。由于“北京方案”和“巴尔的摩方案”具有干细胞采集方便、临床极易操作等优点，且达到了与HLA相合同胞或无关供者移植相当的疗效，因此，这两种方案已经成为国际主流的Haplo-HSCT模式。此外，北京大学团队还发现应用“北京方案”治疗中、高危急性髓系白血病（AML）和成人急性淋巴细胞白血病（ALL）的疗效均优于单纯化疗[20]；治疗儿童恶性血液病的疗效优于脐血移植[21]。更为重要的是，接受“北京方案”治疗的患者生活质量不差于接受HLA相合同胞供者移植的患者[22]。尽管如此，现行的TCR Haplo-HSCT仍存在不足之处，尚有需要改进的空间；例如，“北京方案”治疗后母亲供者移植后的高急性移植物抗宿主病（GVHD）发生率、“巴尔的摩方案”治疗后的高复发率等。本文我们从供者选择、预处理方案的个体化、ATG的最适剂量以及GVHD和复发的防治等方面综述了TCR Haplo-HSCT的疗效改进策略。

表1. 近3年来国内外TCR Haplo-HSCT治疗血液病临床疗效总结.

作者，发表年限[参考文献]	例数	诊断	患者中位年龄（岁）	GVHD发生率（%）		TRM（%）	复发率（%）	LFS（%）	OS（%）
				Ⅱ~Ⅳ度急性	慢性
基于ATG/G-CSF诱导免疫耐受方案
Di Bartolomeo P, et al. 2013[10]	80	HM	37	24	2年17	3年36	1年21	3年38	3年45
王昱,等. 2014[5]	1 210	HM	25	40	50	3年17	3年17	3年67	3年70
罗依,等. 2014[9]	99	HM	25	42.4	2年41.4	5年30.5	5年14.2	5年58.3	5年60.8
高蕾,等. 2014[6]	26	SAA	25.4	8.0	40	2年15.4	NA	NA	2年84.6
Shin SH, et al. 2015[11]	60	MDS	48	36.7	48.3	2年23.3	2年34.8	2年41.9	2年46.6
Yahng SA, et al. 2015[12]	80	AML	41	47.5	45	2年12.2	2年26.6	2年61.1	2年66
林霞,等. 2015[8]	105	HM	23	21.9	2年24.1	3年30.5	3年21.9	3年41.1	3年50.6
TCR haplo-HSCT with PT/Cy
McCurdy SR, et al. 2015[16]	372	HM	55	6个月32	2年13	1年11	3年46	3年40	3年50CR1 77
Bacigalupo A, et al. 2015[13]	148	HM	47	18	2年20	4年14	4年27	NA	CR 249AD 38
Solomon SR, et al. 2015[18]	30	HM	46	43	56	2年3	2年24	2年73	2年78
Cieri N, et al. 2015[14]	40	HM	55	15	1年20	1年17	1年35	1年48	1年56
Esteves I, et al. 2015[15]	16	SAA	17	13	20	1年32.9	NA	NA	1年67.1
Kasamon YL, et al. 2015[17]	271	HM	61	6个月33	1年12	1年10	3年46	3年37	3年46

注：TCR：非体外去除T细胞；haplo-HSCT：单倍型相合造血干细胞移植；GVHD：移植物抗宿主病；TRM：移植相关死亡；LFS：白血病无病生存；OS：总体生存；G-CSF：粒细胞集落刺激因子；ATG：抗胸腺细胞球蛋白；HM：恶性血液病；NA：原文没有提供数据；SAA：重型再生障碍性贫血；MDS：骨髓增生异常综合征；AML：急性髓系白血病PT/Cy：移植后应用环磷酰胺

一、单倍型相合供者选择

多种Haplo-HSCT方案的建立使我们迎来了“人人都有供者”的时代，每位患者不仅有供者，而且可能有数个供者，随之而来的问题是：谁是最合适的供者呢？为此，国内外学者对影响预后的供者因素进行了研究[2],[5],[23]：（1）在“北京方案”和“巴尔的摩方案”中供受者之间HLA不合位点数均对移植预后无影响；（2）无论是TCR还是TCD的Haplo-HSCT模式下，受者体内存在的供者特异性HLA抗体（Donor specific anti-HLA antibody, DSA）与Haplo-HSCT后的移植排斥和植入不良密切相关；（3）供者NK细胞上的杀伤免疫球蛋白抑制性受体（Killer-cell immunoglobulin-like receptor, KIR）与受者HLA相应配基不合（KIR不合）会激活NK细胞的同种反应性，在“北京方案”中KIR不合导致移植后白血病复发率显著增加、无白血病生存（LFS）率降低；（4）在“北京方案”中，①患者接受男性供者移植后LFS和总体生存（OS）率明显高于女性供者；②接受年龄≤30岁供者的移植预后好于年龄>30岁的供者；③与母亲供者相比，父亲供者移植后Ⅱ~Ⅳ度急性GVHD发生率低、移植相关死亡率低、预后好；④非遗传母系抗原（non-inherited maternal antigen, NIMA）不合供者移植后的Ⅱ~Ⅳ度急性GVHD发生率显著低于非遗传父系抗原不合的供者。对于接受“北京方案”治疗的恶性血液病患者而言，应该按以下原则选择供者：首先应该选择DSA阴性的供者；其次应选择供受者之间ABO血型相合的供者；再次要考虑年轻、男性供者；最后还要考虑供受者之间的关系、NIMA不合以及KIR是否相合等。近年来，由于Haplo-HSCT在各方面不断得到完善以及供者特征对临床预后影响研究的不断深入，某些供者特征在供者选择中的作用可能会消失，新的指标又会不断被发现。因此，尽管供者特征选择原则为临床治疗提供了重要信息，但国内外学者应该根据各中心的具体情况，以动态的眼光去看待并选择合适的供者，以期改善Haplo-HSCT预后。

二、预处理方案的个体化

在TCR Haplo-HSCT中，早期的预处方案主要用于白血病、淋巴瘤和骨髓增生异常综合征等疾病的治疗。Xu等[24]采用清髓预处理[白消安（Bu) 3.2 mg·kg⁻¹·d⁻¹，静脉滴注，−7~−6 d；环磷酰胺（Cy）50 mg·kg⁻¹·d⁻¹，静脉滴注，−5~−2 d；兔ATG（法国Sang Stat公司产品）2.5 mg·kg⁻¹·d⁻¹或猪ATG 20 mg·kg⁻¹·d⁻¹，静脉滴注，−5~−2 d]治疗重型再生障碍性贫血（SAA) 19例，结果全部患者获得稳定植入，中性粒细胞和血小板的中位植入时间分别为12 d和18 d，Ⅱ~Ⅳ度急性GVHD和慢性GVHD的发生率分别为（42.1±11.3）％和（56.2±12.4）%，中位随访时间746(90~1 970）d，OS率为（64.6±12.4）%。国内外其他移植中心的学者都证实了TCR Haplo-HSCT（或基于ATG+G-CSF诱导免疫耐受或基于PT/Cy诱导免疫耐受）治疗SAA的可行性。

Fu等[25]用巢式病例配对方法比较了“北京方案”中TBI/Cy+ATG[全身照射（TBI）组：TBI 770 cGy，−6 d; Cy 1.8 g·m⁻²·d⁻¹，静脉滴注，−5~−4 d；司莫司汀250 mg/m²，−3 d；兔ATG 2.5 mg·kg⁻¹·d⁻¹，静脉滴注，−5~−2 d]和改良Bu/Cy+ ATG (Bu组：阿糖胞苷4 g·m⁻²·d⁻¹，−10~−9 d; Bu 3.2 mg·kg⁻¹·d⁻¹，静脉滴注，−8~−6 d; Cy、司莫司汀和ATG用法同TBI/Cy+ ATG组）两种预处理方案治疗急性白血病的疗效，TBI组（38例）和Bu组（77例）造血重建速度相当，TBI组Ⅲ~Ⅳ度急性GVHD发生率与Bu组相比，有降低趋势（2.6％对13.4%，P= 0.083）；Bu组出血性膀胱炎（49.3％对23.7%，P=0.008）和肝毒性发生率（37.7％对10.5%，P=0.002）较高，TBI组腹泻发生较常见（44.7％对22.1%，P=0.031）；两组患者在复发、非复发死亡率（Non-relaspe mortality, NRM）、LFS及OS率差异无统计学意义。作者认为TBI/Cy+ATG预处理耐受性好，是改良Bu/Cy+ATG方案外可供选择的方案。Sun等[26]采用配对（1∶4）方法比较了Bu／氟达拉滨（Flu）方案（用Flu替代Bu/Cy方案中的Cy，其他药物同Bu/Cy方案组，Flu 30 g·m⁻²·d⁻¹，静脉滴注，−6~−2 d）治疗老年患者（17例）和Bu/Cy方案（Ara-C 4 g·m⁻²·d⁻¹，静脉滴注，−10~−9 d；Bu 9.6 mg·kg⁻¹·d⁻¹，静脉滴注，−8~−6 d; Cy 1.8 g·m⁻²·d⁻¹，静脉滴注，−5~−4 d；司莫司汀250 mg/m²，口服，−3 d；兔ATG 2.5 mg·kg⁻¹·d⁻¹，静脉滴注，−5~−2 d）治疗HSCT合并症指数（Hematopoietic stem cell transplant comorbidity index, HCT-CI）≥3的患者（68例）的疗效，结果两组患者复发、NRM、LFS以及OS率差异均无统计学意义，提示对于老年或HCT-CI≥3的患者而言，Bu/Flu和Bu/Cy都是可供选择的预处理方案。

第三军医大学新桥医院张曦教授牵头的一项多中心、随机对照研究入组了178例高危AML患者，这些患者被随机分为联合G-CSF预处理方案组（G-CSF预激组）和无G-CSF预处理方案组（非预激组），结果显示G-CSF预激组和非预激组2年LFS率分别为55.1％和32.6%（P <0.01），两组2年OS率分别为59.6％和34.8%（P<0.01）[7]。基于对G-CSF的认知，笔者推测G-CSF联合清髓预处理可能增强了白血病细胞对化疗的敏感性、降低了复发率。深入研究G-CSF预激背后的机制可能有助于设计更好的预处理方案。

鉴于采用非清髓预处理（Cy 14.5 mg·kg⁻¹·d⁻¹，−6~−5 d；Flu 30 g·m⁻²·d⁻¹，−6~−2 d；TBI 200 cGy，−1 d）的巴尔的摩方案治疗恶性血液病患者后的高复发率[18]，意大利学者Cieri等[14]采用清髓预处理方案联合PT/Cy治疗40例中高危恶性血液病患者，具体预处理方案如下：二羟白消安14 g·m⁻²·d⁻¹，−6~−4 d; Flu 30 mg·m⁻²·d⁻¹，−6~−2 d；马法兰70 mg·m⁻²·d⁻¹，−2~−1 d。作者发现移植后Ⅱ~Ⅳ度急性GVHD发生率为15%，1年慢性GVHD累计发生率为20%，复发率为35%，存活患者中位随访15个月后，1年OS和无病生存（DFS）率分别为56％和48%。最近，欧洲血液和骨髓移植学会（EBMT）急性白血病协作组的回顾性资料证实在TCR Haplo-HSCT模式下，减低剂量预处理和清随预处理的疗效相当，都可以作为高危AML和ALL的一线治疗[27]。目前尚缺乏前瞻性、随机、对照研究资料比较TCR Haplo-HSCT模式中不同预处理方案的优劣。

三、ATG的最佳剂量

ATG诱导免疫耐受是“北京方案”跨越HLA不合免疫屏障的重要机制之一。然而，ATG的最佳剂量目前仍不清楚。北京大学完成的一项随机对照临床研究中，224例接受“北京方案”治疗的标危恶性血液病患者被随机分为6 mg/kg兔ATG组（122例）和10 mg/kg兔ATG组（122例）。Wang等[3]发现10 mg/kg ATG组（ATG-10组）Ⅲ~Ⅳ度急性GVHD发生率显著低于6 mg/kg ATG组（ATG-6组，4.5％对16.1%，P= 0.005），但ATG-10组EBV再活化率显著高于ATG-6组（25.3％对9.6%，P=0.001）；两组患者的1年累计DFS率分别为84.3％和86.0%（P=0.88）。该研究的结果提示尽管ATG-6组EBV在活化率显著降低，却将患者暴露于重度GVHD危险之中。因此，北京大学仍采用10 mg/kg ATG诱导免疫耐受的方案。

南方医科大学刘启发教授牵头的一项随机对照研究中，40例接受TCR Haplo-HSCT的患者被随机分为10 mg/kg兔ATG组（ATG-10组，21例）和7.5 mg/kg兔ATG组（ATG-7.5组，19例），结果显示两组患者在CMV及EBV再活化、Ⅱ~Ⅳ度和Ⅲ~Ⅳ度急性GVHD、慢性GVHD、复发、非复发死亡以及生存方面均差异无统计学意义；作者认为7.5 mg/kg ATG预防GVHD效果与10 mg/kg ATG相当[28]。在TCR Haplo-HSCT方案中，国内外学者应积极开展前瞻性、多中心、随机对照试验以寻找ATG应用的最佳剂量。

四、GVHD的分层预防

急性GVHD仍然是移植后的主要合并症和死亡原因之一，现行的策略是给予所有移植患者同等强度的GVHD预防方案[包括环孢素A(CsA）、ATG以及激素在内的免疫抑制剂等]，这样的结果是降低GVHD发生率的同时，增加了患者感染等合并症的发生率。已有的资料显示多种生物学指标可以预测急性GVHD的发生率，即可将移植患者分为急性GVHD发生的高危人群和标危人群，这些指标包括肿瘤坏死因子-α、移植物中的调节性T细胞以及骨髓移植物中的CD4/CD8比例等[29]。Chang等[30]–[31]借助骨髓移植物中的CD4/CD8比值，将接受“北京方案”治疗的患者分为急性GVHD发生的高危（≥1.16）和低危人群（<1.16）。再将高危人群随机分为小剂量糖皮质激素预防组（试验组）和对照组。结果发现试验组患者移植后Ⅱ~Ⅳ度急性GVHD的发生率与低危人群组相当，显著低于高危对照组（21％对48%，P<0.001）。尽管三组患者在复发、NRM、LFS和OS方面差异无统计学意义，但作者发现试验组移植后100 d内的糖皮质激素应用总量显著低于高危对照组（205 mg对287 mg，P= 0.016），继发性高血压和股骨头坏死的发生率也显著低于高危对照组（P值分别为0.015、0.034）；多因素分析还显示小剂量激素应用显著加快了移植后的血小板重建速度。该研究在国际上首次证实危险分层指导的预防新方法在有效降低高危患者急性GVHD发生率的同时，使低危患者避免不必要激素等免疫抑制剂应用导致的严重不良反应，其推广和应用将使Haplo-HSCT治疗恶性血液病更安全。

五、复发的分层预防

HSCT后复发防治包括减停免疫抑制剂、化疗、传统的供者淋巴细胞输注（DLI）、靶向药物以及二次移植等。由于传统的DLI存在高GVHD发生、全血细胞减少等缺点，北京大学团队应用G-CSF动员的外周血联合小剂量免疫抑制剂建立了改良DLI复发防治体系（Modified DLI, mDLI），具体如下：（1）应用G-CSF动员的外周血移植物代替稳态淋巴细胞采集物（G-CSF-mobilized peripheral blood stem cells, GPBSC），GPBSC中CD34⁺细胞和CD3⁺细胞的中位数分别为0.59（0.15~2.30）×10⁶/kg和0.57（0.40~1.60）×10⁸/kg；（2）给予小剂量CsA预防GVHD：①对于预防性DLI患者，CsA于DLI后开始用至第100天；②对于治疗性DLI患者，CsA于DLI后开始用足6周后停药；以上两种情况均根据血药浓度调整剂量，维持谷浓度150~250 µg/L。近十年来，北京大学团队的系列临床研究表明，改良DLI不仅可用于HLA同胞相合移植后白血病复发的防治，而且还可用于TCR Haplo-HSCT后复发的防治，降低了复发率、改善了移植疗效[32]–[33]。美国约翰霍普金斯大学团队和国内浙江大学团队相继证实了TCR Haplo-HSCT后DLI防治复发的可行性[34]–[35]。

最近，北京大学团队建立了微小残留病（MRD）指导的移植后分层复发防治新方法。814例标危急性白血病患者入组该研究，其中709例MRD阴性（A组）、105例MRD阳性患者中，49例接受小剂量IL-2预防（B组），51例接受mDLI± IL-2预防（C组）。Yan等[36]发现C组患者的复发率显著低于B组，DFS和OS率显著高于B组，与A组差异无统计学意义。多因素分析显示mDLI与MRD是复发和DFS的独立预后因素。可见，危险分层指导的mDLI预防能降低标危AML移植后的复发率，提高DFS率，显著改善患者的移植预后，同时使MRD阴性患者避免了不必要的干预。

六、总结和展望

笔者所在团队的多中心、前瞻性、随机对照研究证实了TCR Haplo-HSCT（“北京方案”）治疗AML、ALL以及MDS可以获得与HLA相合同胞移植相当的疗效[4]，为其临床推广提供了高水平的证据。尽管供者选择、预处理方案个体化、复发和GVHD等问题的初步解决为Haplo-HSCT疗效提高奠定了良好的基础，但是这些问题仍未从根本上解决。另外，TCR Haplo-HSCT应该采用何种移植物，是稳态骨髓或G-CSF预激的骨髓或GPBSC还是G-CSF预激的骨髓和外周血混合移植物，TCR Haplo-HSCT后植入不良、重症肺炎等合并症也亟待解决。上述系列临床问题可归结为HSCT的核心科学问题：免疫耐受和免疫重建。因此，深入阐明Haplo-HSCT中免疫耐受和免疫重建的规律及其细胞和（或）分子调控机制，对建立新的免疫干预新手段，进一步改善移植预后意义重大。

Funding Statement

基金项目：国家自然科学基金（81230013）；首都特色项目（Z141107002514088）