骨髓增生异常综合征（MDS）是一组起源于造血干细胞的异质性髓系克隆性疾病，多种基因突变在MDS预后判断中有重要价值[1]–[3]。10%~21%的MDS患者可检测到U2AF1基因突变，U2AF1基因突变的患者进展为急性髓系白血病（AML）的风险增高[4]–[6]，而这类患者对化疗或异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）治疗反应的报道较少。本研究我们回顾性分析59例U2AF1基因突变MDS患者的临床特征，比较化疗及allo-HSCT的疗效，并分析影响移植患者预后的危险因素。
病例与方法
1．病例资料：回顾性分析2016年7月至2018年12月苏州大学附属第一医院进行二代测序（NGS）检测的251例MDS患者资料，MDS诊断均经骨髓形态学分析、骨髓活检等相关检查确诊，诊断符合参考文献[7]标准。其中U2AF1基因突变59例（23.5%）。根据WHO 2016分型标准[8]分类：MDS伴单系病态造血（MLD-SLD）2例，MDS伴多系病态造血（MDS-MLD）19例，MDS伴原始细胞增多-1（MDS-EB-1）21例，MDS伴原始细胞增多-2（MDS-EB-2）17例。
2．NGS方法：提取初诊患者骨髓单个核细胞，抽提基因组DNA，构建51个血液病相关的常见热点基因Ion AmpliSeq文库，使用ABI Ion Torrent S5测序仪进行检测。NGS扩增子平均基因覆盖率98.03%，平均测序深度2 500×，95%以上的目标区域测序深度2 000×。致病性突变位点主要根据COSMIC数据库及文献报道确定。
3．治疗方法：10例患者接受去甲基化治疗，6例接受去甲基联合预激治疗，7例接受支持治疗。36例患者接受allo-HSCT，其中32例采用改良BuCy（白消安+环磷酰胺）±抗胸腺细胞球蛋白（ATG）预处理方案，2例采用FBAA（氟达拉滨+白消安+阿糖胞苷+ATG）预处理方案，1例采用FluCy（氟达拉滨+环磷酰胺）预处理方案，1例采用克拉屈滨+大剂量阿糖胞苷+白消安预处理方案；接受同胞HLA全相合移植的患者使用甲氨蝶呤（MTX）联合环孢素A（CsA）预防移植物抗宿主病（GVHD），接受无关HLA全相合和单倍型移植的患者使用ATG、MTX、CsA及霉酚酸酯（MMF）预防GVHD。
4．造血重建标准：中性粒细胞绝对计数连续3 d>0.5×109/L为粒系造血重建，PLT连续3 d>20×109/L且脱离血小板输注为巨核系造血重建。
5．疗效评价及随访：根据修订的2006年MDS国际工作组（IWG）治疗反应标准[9]进行评价。随访截止日期为2019年5月31日。化疗组总生存（OS）时间定义为确诊日期至患者任何原因死亡或末次随访日，无进展生存（PFS）时间定义为确诊日期至血液学复发、死亡日期或末次随访日；allo-HSCT组OS时间指定义为干细胞回输至死亡或末次随访日，PFS时间定义为干细胞回输至血液学复发、死亡日期或末次随访日。
6．统计学处理：应用SPSS 25.0软件进行统计分析。计量资料以中位数（范围）表示，采用Mann-Witney U检验进行比较。分类资料以例数（构成比）表示，采用卡方检验或Fisher精确概率法进行比较。采用Cox风险模型进行影响OS、PFS的单因素分析，P<0.05为差异有统计学意义。应用R 3.4.2软件绘制统计图。
结果
1．临床特征：59例U2AF1基因突变患者中，男43例（72.9%），女16例（27.1%），中位年龄44（17~72）岁。初诊时中位WBC 4.49（1.05~22.50）×109/L、PLT 71（4~379）×109/L、HGB 87（43~160）g/L。中位骨髓原幼细胞比例为5.9%（0~18%）。IPSS分组：低危3例（5.1%），中危-1 33例（55.9%），中危-2 17例（28.8%），高危6例（10.2%）；IPSS-R分组：低危11例（18.6%），中危19例（32.2%），高危21例（35.6%），极高危8例（13.6%）。52例患者接受了化疗或allo-HSCT，其中allo-HSCT组36例，化疗组16例，其临床特征见表1。allo-HSCT组中位年龄低于化疗组（41岁对50岁，P=0.002）。
表1. 52例U2AF1基因突变骨髓增生异常综合征患者临床特征.
| 化疗组（16例） | allo-HSCT组（36例） | 统计量 | P值 | ||
| 性别（例，男/女） | 11/5 | 26/10 | 0.729 | 0.69 | |
| 年龄>45岁a［例数（%）］ | 13（81.3） | 14（38.9） | 8.156 | 0.02 | |
| WBC［×109/L，M（范围）］ | 3.96（1.30～22.50） | 5.05（1.05～18.02） | 2.003 | 0.05 | |
| HGB［g/L，M（范围）］ | 83（45～160） | 91（51～137） | 1.401 | 0.38 | |
| PLT［×109/L，M（范围）］ | 51（4～240） | 60（4～355） | 0.297 | 0.65 | |
| 骨髓原幼细胞比例［%，M（范围）］ | 6.1（0～16.0） | 6.4（0～18.0） | 0.050 | 0.86 | |
| IPSS-R［例数（%）］ | 4.939 | 0.53 | |||
| 低危 | 2（12.5） | 7（19.4） | |||
| 中危 | 6（37.5） | 10（27.8） | |||
| 高危 | 4（25.0） | 15（41.7） | |||
| 极高危 | 4（25.0） | 4（11.1） | |||
| 染色体核型［例数（%）］ | |||||
| 正常核型 | 8（50.0） | 15（41.7） | 0.317 | 0.85 | |
| +8 | 3（18.8） | 11（30.6） | 0.790 | 0.67 | |
| -7/7q- | 3（18.8） | 1（2.8） | 5.049 | 0.08 | |
| 基因突变数目≥4个［例数（%）］ | 6（37.5） | 12（33.3） | 1.256 | 0.53 | |
| ASXL1突变［例数（%）］ | 3（18.8） | 14（38.9） | 3.569 | 0.16 | |
| RUNX1突变［例数（%）］ | 6（37.5） | 6（16.7） | 2.759 | 0.25 | |
| SETBP1突变［例数（%）］ | 2（12.5） | 5（13.9） | 0.022 | 0.98 | |
| U2AF1突变类型［例数（%）］ | 3.991 | 0.14 | |||
| S34 | 10（62.5） | 31（86.1） | |||
| 其他 | 6（37.5） | 5（13.9） | |||
| U2AF1 VAF［%，M（范围）］ | 37.9（4.6～49.7） | 37.6（5.5～47.4） | 0.268 | 0.79 | |
注：a：allo-HSCT组为患者移植时年龄；IPSS-R：修订的国际预后积分系统；VAF：等位基因变异频率
2．突变基因检测：251例患者中共检出165个基因突变，患者平均基因突变数为2.8个（范围1~6个）。48例（81.4%）患者合并其他基因突变。与U2AF1基因突变共存的突变频率较高的基因依次为ASXL1（25.6%，21/59）、RUNX1（23.7%，14/59）、ETV6（18.6%，11/42）、SETBP1（13.6%，8/59）、CBL（8.5%，5/59）、TET2（6.8%，4/59）等（图1）。59例U2AF1突变的患者中检出63个U2AF1基因突变位点，其分布如下：2号外显子突变49例（83.1%），其中S34F 30例（50.8%），S34Y 17例（28.8%），R35L及R35W各1例（1.7%）；6号外显子突变5例（8.5%），其中Q157R 3例（5.1%），Q157P 2例（3.4%）；4例（6.8%）患者同时检出S34F和Q157R突变；1例患者为G159插入突变（c.472_477dup TATGAG，p.Glu159_Met160insTyrGlu），63个突变位点的中位等位基因变异频率（VAF）为37.9%（4.6%~49.7%）。
图1. 59例伴U2AF1突变骨髓增生异常综合征患者基因突变谱.
3．生存分析：截至2019年5月31日，中位随访时间为25.2（0.3~34.9）个月，化疗组中位OS时间25.3（1.1~27.1）个月，而allo-HSCT组中位OS时间未达到。allo-HSCT组2年OS及PFS率较化疗组显著增加[OS：（73.2±10.5）%对（51.1±13.9）%，P=0.004；PFS：（70.9±11.4）%对（43.6±14.1）%，P=0.008]。在allo-HSCT组患者中，未合并RUNX1基因突变的患者2年PFS率较合并该突变的患者显著增高（80.0%对50.0%，P=0.002）。12例（33.3%）移植患者存在4个以上的突变基因，突变基因≥4个的患者移植后1年PFS率较突变基因<4个患者显著降低[（61.7±15.6）%对（94.7±5.1）%，P=0.015]，而接受化疗治疗的两组患者1年PFS率差异无统计学意义[（60.0±15.5）%对（66.7±15.2）%，P=0.735]。
4．移植疗效及预后因素分析：36例allo-HSCT患者中，15例移植前获得完全缓解（CR），4例部分缓解（PR），3例处于疾病进展状态（PD），3例转化为AML，11例去甲基治疗桥接移植。HLA全相合移植13例（同胞供者7例，无关供者6例），单倍型移植23例。回输单个核细胞（MNC）9.44（4.35~17.59）×108/kg、CD34+细胞4.76（2.50~10.55）×106/kg。粒系重建、巨核系重建中位时间分别为12（9~28）d、13.5（9~29）d。11例（30.6%）患者发生急性GVHD（aGVHD），中位发生时间35（13~72）d，其中Ⅰ、Ⅱ度6例（16.7%），Ⅲ、Ⅳ度3例（8.4%），不典型2例（5.6%）。9例（25%）患者发生慢性GVHD，中位发病时间140（93~262）d，其中局限型7例（19.4%），广泛型2例（5.6%）。单因素分析显示，突变基因≥4个、RUNX1基因突变为影响患者PFS（HR=2.917，95% CI 0.969~8.787，P=0.057；HR=3.503，95% CI 1.173~10.460，P=0.025）的危险因素。
讨论
近年来随着NGS的广泛应用，在大部分MDS患者中发现了多种涉及RNA剪接机制的重现性体细胞突变[10]–[11]，目前已有大量研究报道这些突变的临床意义，Thol等[12]研究表明SRSF2是MDS患者总体预后不良及高转白风险的独立危险因素，Li等[13]发现突变组总体OS时间较阴性组显著缩短。Wu等[14]表明在中低危组的MDS患者中，U2AF1基因突变与较短的转化为AML（转白）时间相关，类似结论在较早的文献中也有报道[12]。关于allo-HSCT对U2AF1突变的MDS患者预后影响的文献较少，本研究我们观察到allo-HSCT组较化疗组2年OS及PFS率显著增高，伴有RUNX1基因突变是影响患者移植后PFS的危险因素。
本研究中59例患者检测出63个U2AF1突变位点，共4种突变类型，86.4%的基因突变位于S34，14.3%位于Q157，与文献[13]–[14]报道相似。Yip等[15]研究发现U2AF1 S34F突变促进了红细胞的凋亡，提示S34F突变能够破坏细胞生长并增强其凋亡，从而导致骨髓细胞病态造血。本研究中未发现S34F突变患者与其他位点突变患者的临床特征差异具有统计学意义，由于其他位点的突变频率较低，若扩大样本量可能得出更有意义的结论。
本研究中23.5%的患者伴有U2AF1基因突变。分析该组患者突变谱，与U2AF1突变合并出现频率最高的是ASXL1基因（25.6%），而与U2AF1作用机制相同的剪接体基因突变发生率为2.4%，是由于剪接因子的突变通常相互排斥，而与表观遗传修饰因子的突变共存，与文献[16]相一致。RUNX1基因突变检出率（23.7%）仅次于ASXL1基因，已有文献报道MDS患者伴有RUNX1基因突变往往提示预后不良，在髓系肿瘤中RUNX1基因突变型患者（13个月）较野生型（21个月）中位OS时间显著降低[17]。值得注意的是，我们发现伴RUNX1基因突变的患者移植后2年OS率显著低于RUNX1基因突变阴性的患者，同样表示携带该基因的患者预后较差，提示移植可能改善此类患者的预后。此外，MDS患者伴随突变基因的数量是预测疾病进展的危险因素，随着突变数目的增加，患者转白的风险显著增高[18]。本研究中存在4个以上突变基因的患者allo-HSCT后预后不佳，而在化疗组患者中，以上危险因素差异均无统计学意义。
本研究结果显示，allo-HSCT可以改善U2AF1基因突变MDS患者预后，基因突变≥4个、RUNX1基因突变是影响移植疗效的危险因素。
Funding Statement
基金项目: 国家科技重大专项课题 (2017ZX09304021); 国家重点研发计划 (2017YFA0104502); 江苏省医学杰出人才项目 (JCRCA2016002); 江苏省科教强卫工程-临床医学中心 (YXZXA2016002)
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