STAT3磷酸化介导白血病细胞对多柔比星耐药的机制研究

白血病是常见的造血系统恶性肿瘤之一[1]，白血病细胞对化疗药物产生多药耐药（multi-drug resistance，MDR）是临床上导致白血病治疗失败和白血病复发的主要原因[2]。研究表明，STAT3磷酸化能通过多种途径介导肿瘤耐药[3]–[7]。我们此前的研究结果显示，耐药白血病细细胞（K562/AO2）STAT3磷酸化水平明显升高[8]，抑制STAT3磷酸化可以降低耐药白血病细胞P-gp蛋白的表达[9]。本研究中，我们通过转染K562细胞建立耐药白血病细胞株K562/STAT3，阐明STAT3磷酸化介导白血病细胞发生耐药的可能机制。

材料与方法

1．细胞及主要试剂：K562细胞由苏州大学附属医院陈苏宁教授惠赠。抗STAT3抗体、抗磷酸化STAT3（Tyr705）抗体、抗GAPDH抗体购于美国Cell Signaling公司。抗P-gp抗体购于美国Abbiotec公司。STAT3抑制剂（STAT3 inhibitor Ⅶ）购于德国Calbiochem公司。

2．K562/STAT3细胞株的构建和培养：取pcDNA3.1-STAT3质粒和空载体质粒（常州优博精准医疗有限公司产品），按照说明书转染K562细胞，筛选稳定高表达STAT3的细胞（K562/STAT3）进行实验。细胞用含有10%灭活胎牛血清（FBS）、100 U/ml青霉素和100 µg/ml链霉素的PRMI1640培养液，置于5% CO₂、37 °C培养箱内常规培养。

3．MTT法检测细胞增殖抑制率：调整细胞密度为5×10⁵/ml，接种于96孔板，每孔100 µl，分别加入不同浓度的多柔比星，抑制实验中加入2 µmol/L STAT3 inhibitor Ⅶ，培养48 h后每孔加入10 µl MTT标记液再培养4 h（培养条件37°C、5% CO₂），然后加入100 µl DMSO，用酶标仪测定570 nm处吸光度（A）值，计算细胞增殖抑制率。

4．Western blot法检测STAT3磷酸化水平以及P-gp蛋白的表达水平：收集细胞加入裂解缓冲液（裂解缓冲液中提前加入蛋白酶抑制剂和磷酸化抑制剂），提取细胞内总蛋白，测定蛋白浓度。每个电泳孔内加入50 µg蛋白，用10% SDS-PAGE分离蛋白，聚偏氟乙烯膜（PVDF）转膜后，用55 g/L的脱脂奶粉溶液封闭。然后加入单克隆抗体4 °C孵育过夜，充分洗脱后，加入二抗室温孵育2 h后，应用ECL化学发光显色，Image J灰度分析，以GAPDH作为内参。

5．实时荧光定量PCR（RQ-PCR）法检测P-gp基因表达水平：用Isogen提取RNA，然后逆转录成cDNA，储存于-20 °C冰箱待用。LightCycler PCR system分析P-gp基因表达水平。以GAPDH为内参，白血病细胞P-gp基因的表达水平用P-gp mRNA和GAPDH mRNA比值（P-gp/GAPDH）表示。P-gp：上游引物5′-ACAGAGGGGATGGTCAGTGT-3′，下游引物5′-TCACGGCCATAGCGAATGTT-3′。管家基因GAPDH：上游引物5′-CTATTCGATGCCGTGTATGC-3′，下游引物5′-GCCTGGTCCAGACTTCTTTC-3′。

6．白血病患者标本制备：2例复发难治急性髓系白血病（AML）患者标本均来自常州第二人民医院血液科住院患者（M₅和M₄各1例）。初诊和复发时抽取患者外周血5 ml（已获得本单位伦理委员会批准），用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞（PBMC），流式细胞术检测分离PBMC中白血病细胞均超过80%，分离的PBMC用细胞冻存液保存在液氮中备用。

7．统计学处理：采用SPSS17.0统计学软件进行分析。实验数据用均数±标准差表示，两组间比较用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1．K562/-细胞和pcDNA3.1-STAT3转染后细胞（K562/STAT3细胞）内STAT3表达水平及对多柔比星敏感性的变化：Western blot法检测显示，K562/STAT3细胞内总STAT3和磷酸化STAT3表达水平均明显升高（图1）。用MTT法检测多柔比星对K562/STAT3细胞和K562/-细胞增殖的影响，结果显示多柔比星对K562/STAT3细胞的抑制作用明显减弱（图2）。

图1. K562/-细胞和K562/STAT3细胞STAT3和磷酸化STAT3表达水平.

1：K562/-细胞；2：K562/STAT3细胞

图2. K562/-细胞和K562/STAT3细胞对多柔比星的耐药性.

2．K562/-细胞和K562/STAT3细胞P-gp基因及P-gp蛋白的表达水平：RQ-PCR检测结果显示，K562/STAT3细胞P-gp基因表达水平为（360.54±11.22）%，较K562/-细胞的（1.02±0.18）%明显升高（t=45.32，P=0.001）。Western blot法检测显示，K562/STAT3细胞P-gp蛋白表达水平明显升高（图3），表明转染后细胞内STAT3的表达水平影响了P-gp基因和蛋白的表达。

图3. K562/-细胞和K562/STAT3细胞内P-gp蛋白表达水平.

1：K562/-细胞；2：K562/STAT3细胞

3．抑制STAT3磷酸化对K562/STAT3细胞对于多柔比星敏感性的影响：用2 µmol/L的STAT3抑制剂处理K562/STAT3细胞，Western blot法检测发现K562/STAT3细胞的P-gp蛋白表达水平下降（图4）；同时在多柔比星浓度为10 µg/ml的条件下，MTT法检测结果显示用STAT3抑制剂处理过的K562/STAT3细胞在多柔比星中的增殖能力明显下降[（65.67±6.03）%对（83.66±4.04）%，t=4.296，P=0.013]，表明抑制STAT3的磷酸化可以降低P-gp蛋白的表达，从而增加耐药细胞对多柔比星的敏感性。

图4. STAT3抑制剂对K562/STAT3细胞P-gp蛋白表达水平的影响.

1：未加STAT3抑制剂处理组；2：2 µmol/L STAT3抑制剂处理组

4．复发难治白血病患者STAT3磷酸化水平和P-gp基因表达：我们检测2例复发难治白血病患者初诊和复发时的外周血标本，Western blot法检测患者白血病细胞内STAT3的表达水平，结果显示白血病患者复发时细胞内磷酸化STAT3表达水平较初诊时明显升高（图5）。RQ-PCR检测结果显示白血病患者复发时细胞内P-gp基因表达水平较初诊时明显升高（例1：0.35±0.07对0.07±0.05，t=5.638，P=0.005；例2：0.36±0.05对0.13±0.03，t=6.832，P=0.002），表明复发难治患者的白血病细胞内STAT3磷酸化水平以及耐药基因的表达水平均升高。

图5. 两例白血病患者初发时和复发时白血病细胞STAT3和磷酸化STAT3的表达水平.

讨论

STAT3是信号传导与转录激活因子蛋白家族，已有多项研究表明激活的STAT3在肿瘤耐药中起重要作用[4]。多项研究显示，与肿瘤药物敏感株相比，耐药肿瘤细胞株磷酸化STAT3的表达水平明显升高，抑制STAT3磷酸化，耐药肿瘤细胞株对化疗药物的敏感性明显增加[3],[5]–[7],[10]–[11]。既往我们在研究中也发现耐药白血病细胞株K562/AO2细胞内STAT3磷酸化水平明显升高，加入STAT3抑制剂后K562/AO2细胞对多柔比星的敏感性明显上升[8]–[9]。本研究通过转染K562细胞，获得稳定高表达磷酸化STAT3的K562/STAT3细胞株，发现它对多柔比星的敏感性明显下降，表明STAT3磷酸化可能诱导白血病细胞发生化疗耐药。

近年来有研究表明STAT3的活化可通过增加mdr1基因的表达介导乳腺癌细胞发生耐药[12]，降低STAT3磷酸化的水平可以降低耐药蛋白P-gp的表达水平，逆转肿瘤细胞的耐药性[5],[13]–[14]。其机制可能为在P-gp启动子区域中含有一个与STAT3结合的DNA序列，这个序列位于P-gp启动子中P-gp起始编码位点上游1 014 bp处，并具有较强的结合能力[15]。P-gp是一种与耐药相关的高分子糖蛋白，由mdr1基因编码，可利用ATP水解释放的能量将化疗药物泵至细胞外，减弱药物的细胞毒作用，从而导致细胞对结构和作用机制不同的多种化疗药物产生耐药[16]–[17]。本研究发现，K562/STAT3细胞P-gp基因和蛋白的表达明显升高（P=0.001），用STAT3抑制剂干预后，K562/STAT3细胞对多柔比星的敏感性明显升高，同时其P-gp蛋白表达水平明显降低。因此可推断，STAT3磷酸化可能是通过诱导白血病细胞耐药蛋白P-gp的表达，从而产生化疗耐药；抑制STAT3磷酸化可以通过降低P-gp表达水平恢复耐药白血病细胞对化疗药物的敏感性。

我们进一步用白血病患者的白血病细胞验证STAT3磷酸化介导的化疗耐药，我们比较2例AML患者复发时和初诊时白血病细胞的STAT3磷酸化水平以及耐药蛋白P-pg的表达水平，结果显示，AML患者复发时白血病细胞STAT3磷酸化水平以及P-gp基因表达水平均明显升高（P<0.01）。遗憾的是可获得的这两例患者的白血病细胞较少，未能进一步比较患者复发时和初诊时其对多柔比星的敏感程度。

本研究通过转染获得耐药K562/STAT3白血病细胞株，发现STAT3磷酸化水平与白血病耐药密切相关；抑制STAT3磷酸化下调P-gp基因和蛋白的表达，从而逆转白血病细胞化疗耐药。STAT3可能成为有效克服白血病细胞耐药潜在的新靶点，联合靶向STAT3抑制剂可能提高部分耐药白血病细胞对化疗药物的敏感性，为复发难治白血病患者提供可选择的治疗手段。

Funding Statement

基金项目: 常州市科技局应用基础研究计划 (CJ20160018); 常州市高层次卫生人才培养工程 (2016CZLJ027); 江苏省自然科学青年基金 (BK20160283)