尽管酪氨酸激酶抑制剂（TKI）治疗使得慢性髓性白血病慢性期（CML-CP）患者的总生存时间接近正常同龄人群，但治疗期间约三分之一的患者对TKI产生耐药[1]，治疗失败的CML-CP患者最终将进展至急变期（BP），而CML-BP患者的生存期仅6~10个月，预后极差[2]。已知ABL1激酶区突变是导致TKI耐药的主要原因之一。然而，约50%的TKI耐药CML患者检测不到ABL1激酶区突变[3]。ABL1激酶区突变阴性的TKI耐药CML患者的治疗选择仍是困扰临床医师的难题。国外学者研究显示非ABL1基因突变在CML TKI耐药和疾病进展过程发挥重要作用[4]–[6]。国内尚未见类似报道。本中心应用高通量靶向测序法对28例TKI耐药的CML患者进行涵盖82种血液肿瘤相关基因的突变检测，现总结如下。
病例与方法
1．病例资料：以2017年3月至2018年9月于河南省肿瘤医院就诊的28例TKI耐药的CML患者为研究对象。高通量测序检测82种血液肿瘤相关基因，同时应用Sanger测序进行ABL1激酶区突变检测。TKI耐药定义参考文献[7]。
2．ABL1激酶区突变的检测：利用巢式PCR对ABL1激酶区进行突变检测，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，利用Sanger测序仪对PCR产物进行测序，检测ABL1激酶区突变情况。
3．高通量测序：DNA提取试剂盒（美国Gentra公司产品）抽取基因组DNA。验证DNA浓度和纯度后将基因组DNA样品稀释至50 ng/µl。取样品基因组DNA 12 ng，按照Ion AmpliSeq文库试剂盒标准建库流程构建文库；采用AMPure XP磁珠纯化文库，去除小片段，并通过PCR扩增文库。采用赛默飞世尔科技（中国）有限公司的S5系统进行高通量DNA测序，IGV软件分析结果。数据读取时选择外显子上的基因突变。平均基因覆盖率大于99%，平均测序深度为2 000×，检测灵敏度3%~5%。参照文献[8]对所测82种血液肿瘤相关靶基因进行功能分类：①表观遗传相关基因：ASXL1、TET2、WT1、IDH1、IDH2、DNMT3A、SETBP1、EZH2、EP300、ATRX、PAX5；②转录调节基因：RUNX1、GATA2、IKZF1、CREBBP、BCOR、PHF6、CEBPA；③信号传导相关基因：KRAS、NRAS、JAK2、JAK1、JAK3、PTPN11、SH2B3、CBL、KIT、FLT3、PTEN、IL7R、MYD88、NOTCH1、NOTCH2、CSF3R、CCND1、BRAF、CALR、MPL、PIK3CA、ROBO1、ROBO2、STAT3、ID3；④RNA剪接子相关基因：U2AF1、SF3B1、SRSF2、ZRSR2；⑤黏连蛋白复合体基因：RAD21、SMC1A、SMC3、STAG2；⑥肿瘤抑制相关基因：TP53、TNFAIP3、ETV6；⑦细胞凋亡相关基因：BIRC3、BCL2、NPM1；⑧其他功能相关的基因：MLH1、CSF1R、CRLF2、ABCB1、FBXW7、CDKN2A、AKT3、CARD11、CD79B、DIS3、DNAH9、FAM5C、GSTP1、MAP2K1、MEF2B、NF2、NQO1、NT5C2、PML、RHOA、STAT5B、TERC、TERT、SMAD4、TTN。测序后数据利用人基因组数据库（HG19），COSMIC、1000 genomes和dbSNP等数据库进行分析。
4．统计学处理：采用SPSS17.0软件进行分析。分类变量以例数（构成比）表示，采用Fisher确切概率法进行组间比较，P<0.05为差异有统计学意义。
结果
1．高通量测序检测时28例TKI耐药CML患者的临床特征：28例TKI耐药CML患者，包括13例TKI耐药但仍处于CP的患者和15例进展至加速期（AP）或BP的TKI耐药患者，其中AP 5例，BP 10例（急髓变6例和急淋变4例）。男21例，女7例，中位年龄43（12~69）岁。13例CML-CP患者，TKI治疗至首次耐药的中位时间为6（3~16）个月，15例进展期患者，TKI治疗至AP或BP的中位时间为23（3~60）个月。
2．28例TKI耐药CML患者非ABL1基因突变特点：57.1%（16/28）的TKI耐药CML患者检出非ABL1基因突变，其中62.5%（10/16）检出一种基因突变，37.5%（6/16）检出≥2种基因突变，其中4例检出2种基因突变、1例检出3种基因突变、1例检出5种基因突变。按基因功能分类和出现频次依次为：表观遗传学相关基因占42.3%（11/26），包括TET2、ASXL1、WT1、ATRX、IDH2；转录调节相关基因占19.2%（5/26），包括RUNX1、GATA2；信号转导通路相关基因占15.4%（4/26），包括PTPN11、JAK2、CSF1R、KRAS；肿瘤抑制基因占15.4%（4/26），包括TNFAIP3、MLH1；RNA剪接子相关基因占3.8%（1/26）：U2AF1；黏连蛋白复合体基因占3.8%（1/26）：RAD21。
28例TKI耐药CML患者共检出15种非ABL1基因型。出现频率较高的基因型依次为：TET2占17.9%（5/28）、RUNX1占14.3%（4/28）、ASXL1占10.7%（3/28）、TNFAIP3占10.7%（3/28），以上四种突变在CP和进展期均可出现。WT1、U2AF1、JAK2、KRAS、GATA2、IDH2、RAD21、PTPN11、MLH1、ATRX、CSF1R检出率均为3.6%，除CSF1R外其他基因仅在BP中出现，其中RAD21和U2AF1突变在2例髓外急变患者中检出。
3．不同疾病分期CML患者非ABL1基因突变和ABL1激酶区突变表达情况：13例TKI耐药CP患者，非ABL1基因突变检出率为38.5%（5/13），其中20.0%（1/5）为2种非ABL1基因突变。ABL1激酶区突变检出率为7.7%（1/13）。7.7%（1/13）的CP患者同时检出非ABL1基因突变和ABL1激酶区突变。5例检出非ABL1基因突变的CML-CP患者的基因突变情况见表1。15例进展期CML患者，非ABL1基因突变检出率为73.3%（11/15），其中45.5%（5/11）检出≥2种非ABL1基因突变。ABL1激酶区突变检出率为46.7%（7/15），包括T315I、E255K/V、Y253H、M244V、D276G、F359V突变。60.0%（3/5）的AP患者和80.0%（8/10）的BP患者同时检出非ABL1基因突变和ABL1激酶区突变。进展期患者ABL1激酶区突变的检出率显著高于CP患者（P=0.017），非ABL1基因突变检出率显著高于CP患者（P=0.039），进展期≥2种非ABL1基因突变的检出率高于CP患者，但差异无统计学意义（P=0.315）。15例进展期CML患者基因突变情况见表2。
表1. 5例检出非ABL1基因突变慢性髓性白血病慢性期患者的基因突变情况.
| 例号 | 性别 | 年龄（岁） | ABL1激酶区突变 | 非ABL1基因突变 | 外显子 | 氨基酸变化 | 核苷酸变化 | 等位基因变异频率（%） |
| 2 | 男 | 40 | − | CSF1R | 22 | p.Gly936Ser | c.2806G>A | 46.6 |
| TET2 | 11 | p.Ile1762Val | c.5284A>G | 52.6 | ||||
| 4 | 女 | 64 | − | TNFAIP3 | 2 | p.Ala2Pro | c.4G>C | 23.9 |
| 5 | 女 | 69 | T315I | TET2 | 11 | p.Ile1762Val | c.5284A>G | 49.0 |
| 25 | 女 | 60 | − | RUNX1 | 5 | p.S141L | c.C4227 | 15.7 |
| 26 | 男 | 45 | − | ASXL1 | 12 | p.Q695X | c.2083C>T | 8.1 |
注：−：阴性
表2. 15例进展期慢性髓性白血病患者基因突变情况.
| 例号 | 性别 | 年龄（岁） | 疾病分期 | ABL1激酶区突变 | 非ABL1基因突变 | 外显子 | 氨基酸变化 | 核苷酸变化 | 等位基因变异频率（%） |
| 1 | 男 | 31 | AP | T315I | ASXL1 | 12 | p.Asp855fs | c.2562_2563insTT | 48.5 |
| 3 | 女 | 47 | AP | − | − | − | − | − | − |
| 22 | 男 | 27 | AP | T315I | − | − | − | − | − |
| 23 | 男 | 69 | AP | T315I | TET2 | 6 | p.Arg1261His | c.3782G>A | 11.5 |
| ASXL1 | 13 | p.Glu705Ter | c.2113G>T | 49.8 | |||||
| 27 | 男 | 65 | AP | T315I、E255V | TNFAIP3 | 7 | p.Ser544Gly | c.1660A>G | 49.0 |
| 17 | 男 | 28 | 急髓变（髓外） | − | RAD21 | 2 | p.Cys35Gly | c.103T>G | 30.1 |
| 6 | 女 | 57 | 急淋变 | − | TET2 | 3 | p.Asn36Ser | c.107A>G | 49.0 |
| JAK2 | 7 | p.Tyr266Ser | c.797A>C | 9.7 | |||||
| 9 | 女 | 53 | 急淋变 | − | RUNX1 | 6 | p.Arg204Ter | c.610C>T | 41.2 |
| ATRX | 9 | p.Asp766Gly | c.2297A>G | 49.1 | |||||
| 15 | 男 | 43 | 急淋变 | − | TNFAIP3 | 3 | p.Asn102Ser | c.305A>G | 55.2 |
| 19 | 女 | 12 | 急淋变 | − | − | − | − | − | − |
| 8 | 男 | 52 | 急髓变 | M244V、E255K/V、 | PTPN11 | 3 | p.Asn58Tyr | c.172A>T | 13.9 |
| D276G | RUNX1 | 5 | p.Asn146_Thr148dup | c.436_444dupAATGCTACC | 29.7 | ||||
| MLH1 | 12 | p.Lys461Glu | c.1381A>G | 50.6 | |||||
| 10 | 男 | 69 | 急髓变 | − | − | − | − | − | − |
| 12 | 男 | 40 | 急髓变（髓外） | − | U2AF1 | 2 | p.Ser34Phe | c.101C>T | 31.6 |
| 21 | 男 | 23 | 急髓变 | F359V | WT1 | 1 | p.Pro210GlnfsTer34 | c.629_639delCCGCTATTCGC | 21.6 |
| 28 | 女 | 42 | 急髓变 | Y253H | TET2 | 11 | p.Ile1762Val | c.5284A>G | 98.3 |
| GATA2 | 4 | p.Leu321Phe | c.961C>T | 46.6 | |||||
| KRAS | 2 | p.Gly12Asp | c.35G>A | 42.0 | |||||
| RUNX1 | 8 | p.Arg320Ter | c.958C>T | 40.6 | |||||
| IDH2 | 8 | p.Val351fs | c.1050_105linsT | 30.5 |
注：AP：加速期；−：阴性
讨论
二代基因测序技术的广泛应用，进一步揭示了恶性血液病的发生、发展以及耐药的分子机制。近来，多个研究中心应用全外显子测序技术在TKI耐药的CML-CP和进展期以及初诊CML患者中均检出不同比例的非ABL1基因突变，其中以表观遗传学和转录调节相关基因突变较常见[4]–[6]。本研究对28例TKI耐药CML患者检测ABL1基因之外的82种其他血液肿瘤相关热点基因，结果显示：非ABL1基因突变检出率为57.1%（16/28），16例患者共检出15种基因型，62.5%（10/16）的患者检出一种基因突变，37.5%（6/16）的患者检出≥2种基因突变，以表观遗传学相关基因检出率最高，其次为转录调节相关基因、信号转导通路相关基因、肿瘤抑制基因，RNA剪接因子相关基因和黏连蛋白复合体基因比例较低。所涉及的非ABL1基因功能分类同文献[4]–[6]报道一致。TET2、RUNX1、ASXL1、TNFAIP3基因突变在CML-CP和进展期患者中均有出现。而WT1、U2AF1、JAK2、KRAS、GATA2、IDH2、RAD21、PTPN11、MLH1、ATRX仅在BP患者中检出，高频突变型的排序同Soverini等[9]和Grossmann等[10]报道类似，但仍存在一些差异，本研究中TNFAIP3（肿瘤坏死因子α诱导蛋白3）出现频率较文献报道高，2例髓外急变患者分别检出RAD21和U2AF1突变，追溯差异原因可能与不同研究中检测的热点基因的范围存在差异有关，本研究涵盖了82种血液肿瘤相关基因。
研究显示CML TKI耐药和疾病进展可伴有不同程度的体细胞突变及异常基因的累积，且随着疾病进程的演化，突变率呈上升趋势，据报道CML-BP患者的非ABL1基因突变率可达76.9%[9]–[11]。Kim等[5]对13例TKI治疗失败但ABL1激酶区突变阴性的CML患者进行全外显子测序，结果6例患者检出ABL1、ASXL1、DNMT3A、IDH1、SETBP1、TP63突变。该研究者在100例TKI治疗反应不同的CML患者中，应用深度靶向测序法对以上基因进行验证。结果显示疾病进展组、耐药CP组、治疗反应良好组的突变检出率分别为88%（7/8）、28%（5/18）、8.1%（6/74），疾病进展组的中位突变个数较无进展组明显升高（14.5对2）。Branford等[12]对46例TKI治疗反应两极分化的CML患者分别检测肿瘤相关基因突变，数据显示，进展期患者的肿瘤相关基因突变显著高于获主要分子学反应（MMR）患者（56%对16%，P=0.007）。本研究中，进展期CML患者的非ABL1基因突变率和ABL1激酶区突变率均显著高于耐药CML-CP患者（73.3%对38.5%，P=0.039；46.7%对7.7%，P=0.017），同文献报道一致。但本研究仅涉及TKI耐药的CML患者，缺乏与TKI治疗反应良好组患者的对照研究，将在下一步研究中增加TKI治疗反应良好组作为对照队列，以及对比耐药或疾病进展前后突变结果，进一步追踪非ABL1基因突变和ABL1激酶区突变获得的先后顺序及其与疾病特定阶段的关系。
近来，随着血液肿瘤相关热点基因在CML中的研究，研究者发现伴ASXL1突变的CP患者较无ASXL1突变者进展至BP的中位时间显著延长（21个月对4.5个月，P=0.037）[12]。本研究3例伴ASXL1突变患者，分别随访4、9、11个月，无一例进展至BP。有研究者认为转录因子RUNX1是导致CML TKI耐药和疾病进展的独立影响因素[10]。Zhao等[13]在小鼠模型中发现BCR-ABL1和RUNX1突变共表达可诱导CML-BP样疾病，提示RUNX1突变可导致CML疾病进展。本研究4例伴RUNX1突变者，3例（75%）发生急变。去甲基化药物在伴TET2突变而无ASXL1突变的骨髓增生异常综合征患者显示较好疗效[14]。Amabile等[15]在小鼠模型中证实阿扎胞苷（DNA甲基转移酶抑制剂）同样可延长CML的生存。Gallipoli等[16]研究显示尼洛替尼联合芦可替尼（JAK2/STAT5抑制剂）可在体内外清除原代CML干细胞。Jia等[17]在小鼠模型中发现miR-17-92可通过抑制TNFAIP3表达，进而导致NF-κB信号通路激活，最终诱发CML，未来miR-17-92亦有望成为治疗CML的新靶点。
总之，随着基因测序检测深度的提高和检测范围的扩大，越来越多的肿瘤耐药相关分子机制被揭示，为肿瘤的精准治疗提供更多潜在靶点。本组TKI耐药CML患者中检出较高比例的TET2、ASXL1、RUNX1、TNFAIP3突变，为TKI耐药和进展期CML患者联合其他非TKI分子靶向药物治疗提供新的分子靶点，为未来耐药CML的多靶点联合治疗开启新的征程。
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