伴ins（15;17）隐匿型急性早幼粒细胞白血病的遗传学检测及临床研究

Abstract

目的

探讨伴ins（15;17）隐匿型急性早幼粒细胞白血病（APL）的遗传学检测方法及其临床预后。

方法

收集2016年6月至2018年11月收治的373例初诊APL病例，筛选出PML-RARα检测RT-PCR阳性、间期FISH阴性的APL患者进行回顾检测分析，采用中期FISH和Sanger测序进一步验证。

结果

共发现7例隐匿型APL患者，这7例患者15号染色体上分别插入了小的RARα片段，形成ins（15；17）。7例患者中L亚型5例，S亚型1例，V亚型1例。经全反式维甲酸（ATRA）和亚砷酸（ATO）或蒽环类等化疗药物联合化疗后，有6例患者完全缓解，1例患者化疗第6天死于颅内出血。

结论

APL进行FISH检测时应考虑探针大小及覆盖位置，联合中期FISH可提高隐匿型APL检出率。伴ins（15;17）隐匿型APL患者临床特征及治疗方案与经典型APL无差异，ATRA与ATO或蒽环类等联合化疗有效。

急性早幼粒细胞白血病（APL）是急性髓系白血病的一个特殊亚型，约90%的APL患者具有典型的t（15；17）。15号染色体上的PML基因和17号染色体上的RARα基因发生融合，形成PML-RARα融合基因，该融合基因过表达抑制RARα基因的调控，改变PML的核定位，阻滞早幼粒细胞分化成熟和增殖，从而引起APL[1]。涉及15和17号染色体的复杂易位或插入易位，均会产生PML-RARα融合基因[2]。

有极少部分APL患者PML-RARα基因RT-PCR结果为阳性，但是常规染色体核型和FISH检测未发现典型的t（15;17）异常。有可能是因为PML或者RARα的微插入或者复杂变异易位导致了不典型t（15;17），又称为隐匿型易位[3]。隐匿型APL较为罕见，目前国内外已报道的隐匿型APL不足40例，尤其是对ins（15;17）隐匿型APL的认知还很缺乏。APL容易导致DIC，死亡风险高，因此对隐匿型APL的准确诊断显得尤为重要，本研究中我们探讨隐匿型APL更适合的筛查方法及临床预后。

对象与方法

1．研究对象：收集2016年6月1日至2018年11月26日373例经本院分子生物学、流式细胞术免疫分型、形态学等实验室检查综合诊断为APL的初诊患者，筛选PML-RARα融合基因RT-PCR结果阳性及间期FISH结果阴性的APL患者进行回顾性分析，并对筛出患者进行随访。

2．免疫分型：免疫表型分析采用多色流式细胞术，应用单克隆抗体（单抗）免疫荧光标记单个核细胞，上流式细胞仪（BC NAVIOS，Beckman-Coulter，美国BD公司产品）检测分析。采用CD45/SSC设门法，标记的抗体包括：CD117、CD3、cCD3、CD33、CD45、CD123、CD64、CD13、CD56、CD11b、CD36、CD10、CD19、CD14、TDT、MPO、CD5、CD9、CD2、cCD79a、CD7、CD15、HLA-DR、CD4、CD20、CD34、CD38。每个样本分析10 000个细胞。胞质抗原以≥10%为阳性；胞膜抗原以≥20%为阳性。

3．分子生物学分析：取患者骨髓或外周血标本提取总RNA和DNA，采用RT-PCR方法进行PML-RARα基因的定量及定性检测，反应条件、引物及结果判定参照文献[4]–[5]，PCR扩增产物进一步行Sanger测序验证。

4．染色体核型分析：24 h短期培养骨髓细胞（RPMI 1640培养液，美国Gibco-BRL公司产品），固定后收获细胞，火焰法滴片，晾干，吉姆萨染色显G带中期分裂象，核型描述依据《人类细胞遗传学国际命名体制（ISCN2016）》描述。

5．FISH：①间期FISH: PML-RARα双色双融合探针分别选用美国Vysis公司和英国Cytocell公司产品，RARα分离探针选用美国Vysis公司产品。取未培养骨髓细胞，依据试剂厂商提供操作说明书完成杂交。使用荧光显微镜（Olympus BX51）双人分别计数500个细胞。②中期FISH：探针同上，采用24 h短期培养法培养骨髓细胞，分析染色体核型后，标记相应分裂象位置，然后进行FISH杂交（操作步骤同上）。观察标记分裂象的探针信号特征。两个公司探针PML基因均标记为红色（R），RARα基因标记为绿色（G），融合信号（RG）为黄色（F），正常阴性信号为2红2绿（2R2G），典型阳性信号为2黄1红1绿（2F1R1G）。

6．随访：患者完全缓解后每3个月或半年或有病情变化时门诊复查，观察其血常规变化并进行形态学、流式细胞术、遗传学、分子生物学等检测，以评估其病情发展情况，随访截止时间为2019年4月。

结果

1．患者临床特征：373例APL患者中共发现7例隐匿型APL患者，RT-PCR检测PML-RARα融合基因阳性；流式免疫表型均表达或弱表达CD33、CD117、CD13、MPO等，不表达CD34、HLA-DR等（表1）。细胞形态学及免疫组化检测结果均支持APL诊断。根据WBC和PLT进行预后分层[6]，其中高危3例，中危3例，低危1例。7例隐匿型APL患者中6例在应用全反式维甲酸（ATRA）与亚砷酸（ATO）诱导化疗或蒽环类等化疗药物联合化疗中均获得明显的疗效，且在巩固化疗第1~2个疗程均可获得分子生物学完全缓解（即分子生物学定量或定性检测PML-RARα融合基因转阴），维持治疗后病情一直平稳，随访至2019年4月均无复发。例3入院后第6天因颅内出血、肺部感染等并发症死亡。

表1. 7例伴ins（15;17）隐匿型急性早幼粒细胞白血病患者基本临床资料.

例号	性别	年龄（岁）	WBC（×109/L）	HGB（g/L）	PLT（×109/L）	RT-PCR定量（%）	免疫分型	诱导化疗	获初次分子学CR前治疗
1	男	37	8.8	112	21	86.8	表达CD33、CD123、CD117、CD13、CD64、CD9；弱表达MPO、CD38；不表达CD34、HLA-DR、CD7、CD56、CD10、CD19、TDT、cCD79a、cCD3	ATRA+ATO+柔红霉素	1个疗程诱导+ 1个疗程巩固
2	男	30	0.9	67	25	76.5	表达CD33、CD117、CD38、CD13、CD123、CD64、CD9、MPO；弱表达CD15；不表达CD34、HLA-DR、CD11b、CD7、CD36、TdT、CD19、cCD79a、cCD3	ATRA+ATO	1个疗程诱导+ 1个疗程巩固
3	男	12	79.0	61	21	101.4	表达CD13、CD33、CD123、CD64、CD9、CD117；弱表达CD38、MPO；不表达CD34、HLA-DR、CD15、CD11b、CD7、CD36、TdT、CD19、cCD79a、cCD3	ATRA+ATO+柔红霉素	入院第6天死亡
4	女	51	0.4	62	59	27.4	表达CD117、CD13、CD33、CD64、MPO、CD9、CD123；弱表达CD45、CD38；不表达CD34、HLA-DR、CD5、CD7、CD16、CD11b、CD15、CD56、CD19、CD10、CD3、TdT、CD14	ATRA+ATO+蒽环类	1个疗程诱导+ 1个疗程巩固
5	女	26	2.3	73	27	83.6	表达CD33、CD38、CD13、CD123、CD64、CD9、MPO；弱表达CD117；不表达CD34、HLA-DR、CD15、CD56、CD36、CD14、CD4、CD7、CD19、TdT、cCD79a、cCD3	ATRA+伊达比星	1个疗程诱导+ 2个疗程巩固
6	女	45	33.3	37	11	93.4	表达CD117、CD38、CD13、CD33、CD123、CD64、CD9；弱表达MPO；不表达CD34、HLA-DR、CD15、CD11b、CD7、CD36、TdT、CD19、cCD79a、cCD3	ATRA+ATO	1个疗程诱导+ 2个疗程巩固
7	女	33	40.6	68	20	89.3	表达CD117、CD13、CD33、CD123、CD64、CD9；弱表达CD38、MPO；不表达CD34、HLA-DR、CD15、CD11b、CD7、CD36、TdT、CD19、cCD79a、cCD3	ATRA+ATO+阿糖胞苷+伊达比星	1个疗程诱导+ 1个疗程巩固

注：CR：完全缓解；ATRA：全反式维甲酸；ATO：亚砷酸

2．分子生物学特征：7例患者RT-PCR PML-RARα定量及定性检测均阳性，其中L亚型5例，V亚型1例，S亚型1例，Sanger测序进一步证实了这7例患者存在PML-RARα融合基因（图1）。

图1. 7例伴ins（15；17）隐匿型急性早幼粒细胞白血病患者PML-RARα融合基因分型及测序验证.

A：RT-PCR检测PML-RARα基因亚型。条带1～7为例1～7，例1为V亚型，产物178 bp；例2、4～7为L亚型，产物214 bp；例3为S亚型，产物289 bp；C：阴性对照；M：Marker。B：Sanger测序验证PML基因与RARα基因存在融合位点

3．染色体核型检查：7例患者染色体核型分析结果均为正常（图2）。

图2. 隐匿型急性早幼粒细胞白血病患者（例3）染色体核型.

4．FISH检测结果：①间期FISH：7例患者起初使用美国Vysis公司PML-RARα双色双融合探针行间期FISH检测均为阴性，信号特征为2R2G。RARα分离探针检测结果均阴性。随后采用英国Cytocell公司PML-RARα双色双融合探针行回顾检测，结果均为阳性，而且为非典型阳性信号特征1F（Rg）1R2G，融合信号由荧光强度较弱的绿色信号（g）和常规强度红色信号（R）组成。②中期FISH：7例患者采用英国Cytocell公司PML-RARα双色双融合探针检测结果均为阳性，信号特征和间期FISH一致，而且融合信号位于15号染色体上（图3）。

图3. 隐匿型急性早幼粒细胞白血病患者（例3）中期荧光原位杂交（FISH）及染色体核型对照.

A：中期染色体核型；B：双色滤镜下中期FISH；C：单色滤镜下中期FISH。Cytocell公司双色双融合PML-RARα探针，RARα基因荧光标记为绿色（G）, PML基因荧光标记为红色（R），PML-RARα融合信号为黄色（F），阴性信号为2R2G，典型阳性信号为2F1R1G。箭头表示衍生15号染色体PML-RARα融合基因，杂交结果显示为不典型阳性1F（Rg）1R2G，在第15号染色体上显示融合信号F（Rg），g为绿色荧光信号减弱。在图C单色滤镜下间期细胞中也可见减弱的绿色信号（g）

讨论

约90%的APL患者伴有t（15;17）（q24.1; q21.2），位于15号染色体上的5′端PML（外显子1~3）和位于17号染色体上的3′端RARα（外显子3~9）发生融合，形成新的PML-RARα融合基因[7]。此外，还有极少部分APL患者是隐匿型，PML或者RARα发生插入变异，这种插入异常多发在15号染色体上，很少发生在17号染色体上，形成隐匿型PML-RARα融合癌蛋白，被认为是APL主要的“驱动”突变[8]。本研究中7例隐匿型APL患者均是RARα插入到15号染色体长臂中，即ins（15；17），形成PML-RARα融合基因。

间期FISH检测隐匿型APL还存在局限性。对于亚显微插入而形成的隐匿型PML-RARα进行FISH检测时，可能由于插入片段太小，杂交信号弱，肉眼无法识别，从而产生假阴性，而通过单色滤光镜观察可能会有帮助[9]–[12]。7例APL患者先后应用Vysis和Cytocell两个公司的PML-RARα探针进行间期FISH检测，并通过中期FISH验证，发现两次结果存在差异，考虑此种差异与探针大小及探针覆盖位置相关。探针片段越大，检测的精确度越小。Vysis公司PML-RARα探针约1 317 kb（PML约517 kb、RARα约800 kb），Cytocell公司PML-RARα探针约656 kb（PML约325 kb、RARα约331 kb）。Vysis探针大小和其标记覆盖面积是Cytocell探针的2倍以上。因此我们推测PML的信号强度与插入15号染色体长臂的小片段RARα信号强度差异较大，使得PML信号强度遮盖RARα信号，以致融合信号不易发现；而Cytocell公司探针覆盖范围较小，两个信号强度差异也相应减小，使得融合信号肉眼更易识别。此外，如果探针未覆盖插入片段，也会造成杂交信号丢失。探针设计一般会存在未覆盖的间隙，经典的染色体断裂重排均可检测到大片段的分离信号，但若微小片段的插入易位且片段刚好位于未覆盖区域，则检测不到信号。相反，如果RARα探针的3′端覆盖较多，片段插入位置能跳过探针未覆盖间隙，则可被检测到的概率更高。国外相关研究也认为在检测隐匿型APL时，FISH检测结果取决于探针大小及覆盖位置[13]–[14]。

结合中期FISH，我们回顾性分析这7例患者的核型分析结果，发现的确存在微小片段插入异常，但仅凭常规核型分析不能判定为异常。因此，对于初诊ins（15;17）或者其他隐匿型APL患者，间期FISH检测应综合考虑探针的大小和覆盖范围，并联合中期FISH验证以提高检出率。而且通过中期FISH的荧光定位，我们还可以更清楚地了解染色体重排发生机制。

PML-RARα转录本亚型分为L亚型、V亚型及S亚型。本研究中7例患者的PML-RARα融合基因亚型未见特异性分布。但因样本量较小，确切的结论还需要扩大病例数进一步研究。

对于经典t（15;17）APL患者，根据APL治疗指南（2018版），应用ATRA和ATO诱导化疗已经是非高危APL患者一线治疗的首选方案[6]。而APL变异型的RARα基因多与其他伙伴基因形成融合基因如PZLF-RARα和STAT5b-RARα等，不存在PML-RARα融合基因靶点，通常会对ATRA具有耐药抗性[15]–[16]。本研究中的隐匿型ins（15;17）虽然与经典t（15；17）形成重排机制不同，但由于同样存在PML-RARα融合基因靶点，因而这类患者对联合诱导治疗具有明显疗效，与经典t（15;17）APL患者一样有着良好的预后，我们的结果与以往文献报道一致[3],[6],[14]。

综上，当疑似APL初诊患者出现PCR、间期FISH及染色体核型结果不一致的时候，应首先考虑是否存在隐匿型变异，此时选用探针的大小及覆盖位置很重要，精准度高的探针可有效提高检出率，应用中期FISH验证可得到更加准确的结果。同时，提高实验室及临床人员对少见类型APL的认识，对APL患者的快速诊断、临床合理用药及预后评估具有重要意义。