虽然已陆续发现一些与癌症发生发展相关的功能性长链非编码RNA（lncRNA），但人们对lncRNA功能和机制的研究尚处于起步阶段，目前已知确切功能的lncRNA数量极少。lncRNA与多种血液系统疾病相关，然而其在白血病发病中的作用尚不清楚。我们前期实验揭示了急性白血病（AL）患儿lncRNA与正常儿童存在明显差异[1]，本研究选取差异最显著的AC002454.1，探讨AC002454.1在儿童AL中的表达及其对NB4白血病细胞生物学功能的影响。
对象与方法
一、研究对象
选取经细胞形态学、免疫学、细胞遗传学和分子生物学（MICM）分型诊断的初诊AL患儿43例，其中急性淋巴细胞白血病（ALL）21例、急性髓系白血病（AML）22例；中位年龄5.85（1.3岁~13.0）岁，男31例、女12例。骨髓象正常的21例非恶性血液病患儿作对照组，中位年龄7.1（0.7~15.0）岁，男9例、女12例。收集骨髓标本用于lncRNA芯片扫描及实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测，并对在儿童AL中显著异常表达的lncRNA进行验证。标本采集经医院伦理委员会批准及患者知情同意。
二、细胞株和培养
白血病细胞株NB4购于美国模式培养物集存库（ATCC）。培养于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中，采用37 °C、含5% CO2的恒温无菌培养箱培养。
三、主要试剂
基因芯片表达配套试剂盒购自美国Agilent公司；SuperRT cDNA第一链合成试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司；SYBR Green mix购自瑞士Roche公司；Cell Counting Kit-8试剂盒购自上海华雅思创生物科技有限公司；溴化乙锭（PI）、Triton X-100购自上海生工生物工程技术服务有限公司；RNase A购自美国Thermo Scientific公司；PE Annexin Ⅴ Apoptosis Detection Kit 1购自美国BD公司；RIPA裂解液、BCA蛋白定量试剂盒购自江苏碧云天生物技术研究所；TRIzol、SDS、聚丙烯酰胺、蛋白Marker购自美国Invitrogen公司；PVDF膜、化学发光试剂盒购自美国Millipore公司；鼠抗人GAPDH抗体、鼠抗人CDK6抗体、鼠二抗购自美国Cell Signaling Technology公司。
四、实验方法
1．lncRNA芯片扫描和数据分析：将骨髓单个核细胞标本加入1 ml TRIzol，干冰运输至上海康成生物工程有限公司进行，经过Microarray基因芯片扫描仪扫描后得到原始数据，原始数据经过统计软件转换后进行统计分析，经过图像采集和数据分析后得到lncRNA数据，设定差异表达的标准：差异改变倍数≥2.0，P<0.05，根据此标准筛选得到AL患儿与对照组之间lncRNA的差异表达谱。
2．qRT-PCR：利用实时荧光定量PCR仪（LightCycler 480® Ⅱ，瑞士Roche公司产品）检测lncRNA相对表达量，由Invitrogen公司合成引物。定量PCR扩增反应体系20 µl，含0.2 mmol/L引物各0.1 µl，10 µl SYBR Green mix；反应条件：95 °C预变性10 min，95 °C变性15 s，60 °C退火15 s，72 °C延伸60 s，共进行45个循环，后95 °C 10 s，65 °C 60 s，4 °C∞。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）为内参基因，以104×2−ΔCT计算每个基因的相对表达量。
3．细胞株的收获与冻存：待NB4细胞处于对数生长期，细胞密度达1×l06/ml时收获细胞。1 500 r/min离心5 min，弃上清，保留细胞沉淀，每管中各加入1 ml冻存液，混匀，编号后放入−80 °C冰箱保存。
4．RNA的提取和cDNA合成：采用TRIzol提取细胞的总RNA后，采用分光光度计测定RNA浓度，通过琼脂糖凝胶电泳评估RNA纯度。将所得的RNA利用SuperRT cDNA第一链合成试剂盒10 µl体系逆转录cDNA。
5．AC002454.1沉默病毒的设计、合成及细胞转染：AC002454.1沉默病毒由上海吉凯基因化学技术有限公司完成。根据试剂盒说明书操作。实验分为3组：实验组为NB4细胞转染时加入AC002454.1沉默病毒；阴性对照组为NB4细胞转染时加入阴性对照病毒；空白对照组为未进行任何干预的NB4细胞。并利用流式细胞仪检测转染效率。
6．CCK-8法检测细胞增殖：收集空白对照组、阴性对照组及实验组对数生长期细胞（5×104/ml）分别接种于4块96孔板中，空白对照组、阴性对照组、实验组及培养基对照组各设5个平行孔，培养24、48、72、96 h检测细胞增殖情况，按照CCK-8试剂盒操作说明，检测前每孔各加入20 µl CCK-8试剂，后于37 °C、5%CO2恒温培养箱孵育2 h，于酶标仪检测，在450 nm波长处读取相应的吸光度（A）值。
7．细胞周期检测：取对数生长期细胞，制备单细胞悬液；PBS洗涤2次，离心后弃上清液；加入预冷的75%乙醇固定，吹打均匀，4 °C固定过夜；检测前离心，PBS洗涤2次；加入500 µl PBS（含50 µg/ml PI）、100 µg/ml RNase A、0.2% Triton X-100，4 °C避光孵育30 min；流式细胞术检测各周期DNA含量。实验重复3次。
8．细胞凋亡检测：制备单细胞悬液，调整细胞密度，以每孔2×105细胞接种于6孔板，培养48 h，PBS洗涤2次，离心收集并重悬计数，保证每个待检样本细胞量为（5~10）×105个；离心收集细胞后，加入100 µl 1×结合缓冲液，吹匀；加入5 µl 7-ADD及5 µl PE，25 °C避光放置，流式细胞术检测分析；结果判定：左下象限显示活细胞；其余象限为凋亡细胞。
9．Western blot法测定蛋白表达：收集各组细胞采用RIPA裂解液裂解后提取蛋白，应用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量。取20 µg总蛋白行SDS-PAGE，然后转移至聚偏二氟乙烯膜，膜封闭后加入一抗孵育过夜，TBST洗膜后加入二抗稀释液封闭1 h，洗涤后用增强的化学发光试剂盒显影，利用Amersham Imager 600显像系统扫描条带。
五、统计学处理
采用SPSS 17.0软件进行统计处理，同时采用GraphPad Prism 5软件进行绘图。结果以均数±标准差表示，两样本均数的比较采用t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
结果
1．筛选并验证儿童AL异常表达的lncRNA：从前期研究基因芯片数据中选取了97个异常表达的lncRNA，对21个儿童ALL样本、22个儿童AML样本和21个对照样本进行qRT-PCR验证并比较。结果显示：和对照样本比较，儿童ALL组16个lncRNA表达差异显著（P值均<0.05），其中9个上调（uc002ehu.1、AC002454.1、uc001guz.2、BC035649、uc001kpt.2、AK123765、NR_026776、NR_027182、ENST00000508489），7个下调（ENST00000415964、uc010arh.1、ENST00000457799、ENST00000511213、NR_002712、X61079、ENST00000417930）；儿童AML组24个lncRNA表达差异显著（P值均<0.05），其中12个上调（AC002454.1、uc002ehu.1、ENST00000509150、uc001guz.2、ENST00000457457、uc001kpt.2、NR_027182、AK123765、BC031319、AK124936、uc003hhv.1、NR_026776），12个下调（AK027193、AK024584、BC005232、AK094982、uc003ebe.1、ENST00000512129、AF088004、uc002vje.1、uc010arh.1、ENST00000428188、ENST00000457799、ENST00000415964）。AC002454.1表达差异最显著（P=0.040，P=0.002），尤其在AML组表达明显升高（图1）。
图1. AC002454.1在对照组、急性淋巴细胞白血病（ALL）组和急性髓系白血病（AML）组的表达.
2．AC002454.1沉默病毒的构建及转染效率：构建沉默AC002454.1的慢病毒载体并转染至NB4细胞中。多次行转染实验，当转染条件被优化到转染效率>50%时，行下一步实验的检测（图2）。
图2. AC002454.1沉默病毒对NB4细胞的转染效率.
A：流式细胞术显示NB4转染组的效率为80.2%；B：实时荧光定量PCR实验显示沉默AC002454.1基因的慢病毒载体可以下调NB4细胞的AC002454.1的表达
3．AC002454.1对NB4细胞增殖的影响：用沉默AC002454.1的慢病毒载体转染NB4细胞，采用CCK-8细胞增殖检测试剂盒分析其对细胞增殖的影响，结果显示48、72、96 h实验组均出现细胞增殖抑制（P值均<0.01）（图3）。
图3. 下调AC002454.1表达对NB4细胞增殖的影响（实验重复3次。与阴性对照组比较，aP<0.01）.
4．AC002454.1对NB4细胞周期的影响：流式细胞术检测结果显示，下调AC002454.1表达后G2/M期NB4细胞比例显著增加（P<0.01）（图4）。
图4. 下调AC002454.1表达对NB4细胞周期的影响（实验重复3次。与阴性对照组比较，aP<0.01）.
5．AC002454.1对NB4细胞凋亡的影响：流式细胞术结果显示，空白对照组、阴性对照组、实验组的凋亡率分别为（0.80±0.53）%、（0.80±0.44）%和（4.53±0.90）%，下调AC002454.1表达后NB4细胞凋亡率增加（P=0.003）。
6．AC002454.1对CDK6蛋白表达的影响：采用Western blot方法检测转染后的NB4细胞CDK6表达。结果显示，下调AC002454.1表达后NB4细胞的CDK6蛋白表达下降（图5）。
图5. Western blot法检测下调AC002454.1表达后NB4细胞CDK6蛋白的表达.
1：空白对照组；2：阴性对照组；3：实验组
讨论
目前研究提示lncRNA的功能异常与人类多种肿瘤密切相关，如MALAT1是最早发现与肿瘤相关的lncRNA之一，在肺癌、膀胱癌、乳腺癌等多种肿瘤中发现MALAT1水平上调，提示MALAT1可促进肿瘤细胞增殖导致肿瘤发生[2]。MEG3被发现有肿瘤抑制功能，在多种正常组织尤其是脑组织中呈现高表达，但在肺癌、肝细胞癌、脑膜瘤等肿瘤表达下降[3]。lncRNA在白血病发生、发展过程中的作用也有较多探索。Hirano等[4]发现，CCDC26通过调节KIT表达来控制髓样白血病细胞的生长，KIT抑制剂可能是对CCDC26有改变的AML患者有效的治疗药物。Trimarchi等[5]发现，LUNAR1能够调控IGF1R基因的表达、IGF1信号转导和T-ALL的生长，表明LUNAR1可以作为T-ALL的生物标志物和治疗靶点。Guo等[6]发现BGL3可以作为竞争性内源RNA结合miR-17、miR-93、miR-20a、miR-20b、miR-106a和miR-106b来交叉调节PTEN表达，同时BCR-ABL通过c-Myc依赖性DNA甲基化抑制BGL3表达，揭示了BCR-ABL介导的细胞转化关键需要肿瘤抑制因子BGL3的沉默，并且提出了用于治疗BCR-ABL阳性白血病的潜在策略。以上研究提示，lncRNA在白血病的发生、发展中发挥重要作用，可作为白血病诊断的标志物，也是白血病治疗的潜在药物靶点。本研究从基因芯片数据中选取了97个异常表达的lncRNA，对21个儿童ALL样本、22个儿童AML样本和21个对照样本进行qRT-PCR验证并比较，结果发现AC002454.1表达差异最显著。对于AC002454.1目前少有研究，仅有研究提示AC002454.1可能参与子宫内膜异位症的发病机制[7]。本研究显示AC002454.1在AL患儿的表达显著高于对照组，尤其在AML表达更为显著，提示AC002454.1可能作为癌基因参与儿童AL的发生和发展。
本研究用沉默AC002454.1的慢病毒载体转染白血病细胞株NB4，分析AC002454.1对NB4细胞增殖和细胞周期的影响，结果显示沉默AC002454.1表达后NB4细胞增殖受到明显抑制，G2/M期显著延长。研究表明G2/M期阻滞的细胞非常易于凋亡，其增殖能力明显降低[8]，提示AC002454.1对NB4细胞的增殖起促进作用并可抑制其凋亡。
本研究前期对基因芯片生物信息经Pathway与GO分析均提示，儿童AL中显著上调的lncRNA在细胞周期中可能具有重要功能，我们查阅（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene）网站，AC002454.1位于人类染色体7: 92836483-92917187，正靠近CDK6（位于人类染色体7: 92604921-92836627）。
CDK6是细胞周期素依赖激酶（Cyclin-Dependent Kinases, CDK）的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族中的一员，CDK主要负责哺乳动物细胞的增殖，参与细胞周期进展和细胞分化[9]。研究表明CDK6可以通过结合EYA2蛋白并促进其降解，直接调控细胞周期，并在某些类型的细胞增殖和分化中起着重要的作用[10]。业已证实，在人体的很多肿瘤中CDK6、E2F-1表达均呈组蛋白修饰长链非编码RNA出现异常，其与肿瘤的发生发展有密切联系。高表达的CDK6可以促进白血病细胞的增殖及阻碍细胞分化，从而导致了白血病的发生，CDK6还是MLL-AF4融合蛋白的直接靶点，促进MLL基因重排的白血病细胞增殖，是MLL基因重排的白血病发生和进展的重要因素[11]–[13]。现有研究发现，CDK4/6抑制剂可通过抑制Rb磷酸化而抑制人类表皮生长因子受体2阳性乳腺癌细胞增殖[14]。在造血系统疾病方面，CDK4/6抑制剂Pd0332991通过阻滞细胞于G1期来抑制Ph+ ALL细胞株的增殖[15]。
为探讨AC002454.1与CDK6间的相关性，本实验采用Western blot方法检测转染后NB4细胞的CDK6表达。结果显示：下调AC002454.1表达后NB4细胞的CDK6表达明显低于空白对照组及阴性对照组，提示下调AC002454.1能降低NB4细胞CDK6表达，有望作为治疗白血病的靶标之一。
综上所述，AC002454.1在AL儿童表达明显高于正常儿童，说明AC002454.1可能参与儿童白血病的发生和发展。AC002454.1有促进NB4细胞增殖和抑制其凋亡、并使其G2/M期缩短影响细胞周期的功能。下调AC002454.1表达后NB4细胞的CDK6表达明显降低，提示AC002454.1可能通过增强CDK6表达促进白血病细胞的增殖，然而AC002454.1与CDK6相互作用机制尚不清楚，将在我们今后的研究中进一步探讨。
Funding Statement
基金项目：江苏省青年医学人才项目(QNRC2016760)；江苏省社会发展项目(BE2017659)
References
- 1.Cao L, Xiao PF, Tao YF, et al. Microarray profiling of bone marrow long non-coding RNA expression in Chinese pediatric acute myeloid leukemia patients[J] Oncol Rep. 2016;35(2):757–770. doi: 10.3892/or.2015.4415. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 2.Zhang X, Hamblin MH, Yin KJ. The long noncoding RNA Malat1: Its physiological and pathophysiological functions[J] RNA Biol. 2017;14(12):1705–1714. doi: 10.1080/15476286.2017.1358347. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 3.He Y, Luo Y, Liang B, et al. Potential applications of MEG3 in cancer diagnosis and prognosis[J] Oncotarget. 2017;8(42):73282–73295. doi: 10.18632/oncotarget.19931. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 4.Hirano T, Yoshikawa R, Harada H, et al. Long noncoding RNA, CCDC26, controls myeloid leukemia cell growth through regulation of KIT expression[J] Mol Cancer. 2015;14:90. doi: 10.1186/s12943-015-0364-7. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 5.Trimarchi T, Bilal E, Ntziachristos P, et al. Genome-wide mapping and characterization of Notch-regulated long noncoding RNAs in acute leukemia[J] Cell. 2014;158(3):593–606. doi: 10.1016/j.cell.2014.05.049. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 6.Guo G, Kang Q, Zhu X, et al. A long noncoding RNA critically regulates Bcr-Abl-mediated cellular transformation by acting as a competitive endogenous RNA[J] Oncogene. 2015;34(14):1768–1779. doi: 10.1038/onc.2014.131. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 7.Wang Y, Li Y, Yang Z, et al. Genome-Wide Microarray Analysis of Long Non-Coding RNAs in Eutopic Secretory Endometrium with Endometriosis[J] Cell Physiol Biochem. 2015;37(6):2231–2245. doi: 10.1159/000438579. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 8.Wang H, Zhang X, Teng L, et al. DNA damage checkpoint recovery and cancer development[J] Exp Cell Res. 2015;334(2):350–358. doi: 10.1016/j.yexcr.2015.03.011. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 9.Lim S, Kaldis P. Cdks, cyclins and CKIs: roles beyond cell cycle regulation[J] Development. 2013;140(15):3079–3093. doi: 10.1242/dev.091744. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 10.Giessrigl B, Schmidt WM, Kalipciyan M, et al. Fulvestrant induces resistance by modulating GPER and CDK6 expression: implication of methyltransferases, deacetylases and the hSWI/SNF chromatin remodelling complex[J] Br J Cancer. 2013;109(10):2751–2762. doi: 10.1038/bjc.2013.583. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 11.Kollmann K, Heller G, Ott RG, et al. c-JUN promotes BCR-ABL-induced lymphoid leukemia by inhibiting methylation of the 5′ region of Cdk6[J] Blood. 2011;117(15):4065–4075. doi: 10.1182/blood-2010-07-299644. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 12.van der Linden MH, Willekes M, van Roon E, et al. MLL fusion-driven activation of CDK6 potentiates proliferation in MLL-rearranged infant ALL[J] Cell Cycle. 2014;13(5):834–844. doi: 10.4161/cc.27757. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 13.Placke T, Faber K, Nonami A, et al. Requirement for CDK6 in MLL-rearranged acute myeloid leukemia[J] Blood. 2014;124(1):13–23. doi: 10.1182/blood-2014-02-558114. [DOI] [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
- 14.Corona SP, Ravelli A, Cretella D, et al. CDK4/6 inhibitors in HER2-positive breast cancer[J] Crit Rev Oncol Hematol. 2017;112:208–214. doi: 10.1016/j.critrevonc.2017.02.022. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]
- 15.Nemoto A, Saida S, Kato I, et al. Specific Antileukemic Activity of PD0332991, a CDK4/6 Inhibitor, against Philadelphia Chromosome-Positive Lymphoid Leukemia[J] Mol Cancer Ther. 2016;15(1):94–105. doi: 10.1158/1535-7163.MCT-14-1065. [DOI] [PubMed] [Google Scholar]