遗传性口形红细胞增多症发病机制及诊断

遗传性口形红细胞增多症（HSt）属于常染色体显性遗传病，由于红细胞膜转运蛋白的遗传缺陷导致Na⁺和K⁺异常通透，影响细胞水和离子间平衡，从而引起红细胞体积变化，使得红细胞形态似口形。临床上以不同程度的慢性溶血性贫血、黄疸、脾大为特征。迄今为止，报道了6种不同的膜蛋白突变导致体积稳态改变的HSt[1]。现将其发病机制及诊断介绍如下。

一、HSt的分类

红细胞膜由磷脂双分子层和镶嵌其中的蛋白质构成，其结构性质和功能主要由50多种跨膜蛋白和10余种骨架蛋白决定的。大多数红细胞跨膜蛋白的功能是转运细胞内外物质，少数跨膜蛋白还可以与骨架蛋白锚定，维持红细胞双凹圆盘状及可变形性。红细胞的双凹圆盘结构可以使其自由地通过微血管和脾窦。稳态时，红细胞膜可渗透低水平的阳离子，维持细胞内外阳离子和水的平衡，防止由渗透压的改变引起细胞肿胀[2]。而基因突变导致红细胞膜转运蛋白缺陷、离子通透性增强，形成口形红细胞，目前HSt可分为以下几类。

1．过度充水型遗传性口形红细胞增多症（OHSt）：1961年Lock等首次报道OHSt，患者Na⁺-K⁺ATP酶（Na⁺-K⁺ATPase）活性增高，进而糖酵解增强以提供更多的ATP，Na⁺流入远多于K⁺流出，导致细胞内Na⁺含量升高，K⁺含量降低，红细胞阳离子渗透率比正常人高20~40倍，导致红细胞体积肿胀，平均红细胞体积（MCV）增大（100~150 fl），平均红细胞血红蛋白浓度（MCHC）降低（240~300 g/L），渗透脆性升高。大多数病例可见STOM基因编码人红细胞膜整合蛋白（stomatin，band 7.2）缺失，但它是OHSt的诱因还是结果仍未知[3]。

2．脱水型遗传性口形红细胞增多症（DHSt）：DHSt又称遗传性干瘪细胞增多症（HX），首次报道于20世纪70年代，特点是K⁺渗漏远远多于Na⁺内流，从而导致细胞内K⁺含量降低、胞内低渗、细胞脱水[3]。在HSt中，DHSt最为常见，患者伴有大量溶血，严重程度不一。一般来说DHSt患者呈现代偿性溶血性贫血：网织红细胞计数增高、大细胞倾向、轻度黄疸。红细胞的主要特征是阳离子含量损失导致的细胞脱水，伴或不伴MCHC增高[1],[4]。

3．冷性充水细胞增多症（CHC）：CHC属于温和形HSt，其特征是高胆红素血症和低温下K⁺外流。患者有轻度至中度溶血，伴或不伴贫血。患者红细胞在37 °C时几乎无异常表现或仅呈轻度阳离子泄漏，但在低温时，阳离子渗透增加、红细胞肿胀。CHC患者红细胞在23 °C时阳离子泄漏最少，20 °C以下K⁺泄漏增加，超过Na⁺-K⁺ ATPase的补偿能力。4 °C冷藏后细胞体积变大，并存渗透脆性增高，冷藏过夜后细胞裂解率可达到50%[5]。

4．家族性假性高钾血症（FP）：FP通常无临床表现，37 °C时MCV正常。但血液储存温度低于37 °C时，红细胞内的K⁺大量流出，导致血浆中K⁺浓度升高，细胞膜破裂，发生溶血[6]。因此FP患者献血时，血液低温保存，此时红细胞才会表现溶血。FP与ABCB6基因突变有关，ABCB6突变引起转运过程中的动力学改变，在红细胞中的表现则是低温时K⁺泄漏增加，但体温时无表现，形态学无明显异常。临床输血时，若储存血液制品中血浆K⁺浓度过高，超过血液制品储存标准，则会对受血者造成伤害。研究发现，杂合子突变在欧洲人群中的频率是1∶500，属于常见的单核苷酸多态性，不能说明ABCB6突变就会致病。需要进一步的研究探讨温度低于37 °C时，突变的ABCB6使红细胞的阳离子泄漏增加的机制[6]–[8]。

二、生化诊断

HSt通常需要结合临床表现、家族史、外周血涂片检查、红细胞渗透脆性试验、酸化甘油溶血试验（AGLT₅₀）、渗透梯度激光衍射法（EKTA）等结果综合诊断。HSt各亚型实验室指标特点如表1[9]。

表1. 遗传性口形红细胞增多症（HSt）不同亚型特征概述[9].

特征	OHSt	DHSt	CHC	FP
细胞形态学	大细胞、口形	口形、靶形	口形	大致正常
HGB	80～100 g/L	120～150 g/L	100～120 g/L	正常
MCV	120～140 fl	98～120 fl	正常	正常或偏高
MCHC	240～280 g/L	350～370 g/L	正常	正常
Ret%	10%～15%	0～10%	0～8%	正常
胞内离子水平	正常Na+/K+转运速率的40倍	不正常，但比OHSt小	低温时K+泄漏	血标本在室温放置数小时后血浆K+升高
糖酵解代谢产物	还原型2,3-DPG、氧化谷胱甘肽、肌酸、硫组氨酸甲基内盐	还原型2,3-DPG	未知	正常
结合珠蛋白	降低	降低	降低	正常
患病率	百万分之一	万分之一	极少	极少
可能致病的突变基因	SLC4A1、RhAG、SLC2A1	PIEZO1、KCNN4	SLC4A1	ABCB6

注：OHSt：过度充水型HSt；DHSt：脱水型HSt；CHC：冷性充水细胞增多症；FP：家族性假性高钾血症；MCV：平均红细胞体积；MCHC：平均红细胞血红蛋白浓度；Ret%：网织红细胞比例；还原型2,3-DPG：还原型2,3-二磷酸甘油酸

患者均具有血管外溶血临床表现，如不同程度的贫血、黄疸、脾肿大。胆结石为常见并发症。目前报告HSt均为显性遗传，故应问诊家族史，同期进行相关指标的家系分析。通常外周血涂片中口形红细胞≥5%，但分型需基因诊断支持。OHSt患者可表现渗透脆性增加，而DHSt患者渗透脆性降低或不变[1]。理论上HSt患者AGLT₅₀缩短。但AGLT₅₀特异性差，非遗传性红细胞膜病如自身免疫性溶血性贫血、肾衰竭、妊娠等AGLT₅₀也可缩短[10]。EKTA是对HSt最有价值的诊断方法，已被国际血液标准化委员会（ICSH）列为HSt诊断的金标准，国内尚未开展使用。该方法对红细胞的变形能力、抗渗透能力、水合状态进行测定，监控红细胞在已知切变力的渗透梯度范围内的变形性，常用3个指数：渗透梯度变形指数（DI）、渗透参数（O）、细胞水合指数（Hyper）。DI反映与膜缺陷相关的细胞变形能力，DI_max代表红细胞最大变形指数；O_min代表红细胞变形指数最小时的渗透压，反映膜表面积与体积之比；Hyper代表DI_max达50%时的渗透压，反映脱水/水合程度。OHSt的O_min和Hyper右移；DHSt的DI_max正常，O_min和Hyper左移，表明红细胞脱水[9]。

最近有文献将谷甾醇血症并入HSt，虽然红细胞形态有口形改变，但其致病机制并非一价阳离子转运异常[11]。所以鉴别诊断中应注意排除其他口形增多的原发和继发性疾病，如：家族性高密度脂蛋白缺乏症、谷甾醇血症、Rh缺乏综合征、肝胆疾病、心血管疾病、酒精中毒、肿瘤等。DHSt亦可见于血红蛋白C病、镰刀细胞贫血、丙酮酸激酶缺乏症等疾病。由于骨髓涂片中红系增生伴巨核系生成障碍，DHSt易误诊为骨髓增生异常综合征（MDS）[12]。因此HSt的诊断通常需分子诊断支持。

三、分子诊断

（一）OHSt

最初发现OHSt患者有STOM基因突变，认为STOM缺失是造成口形细胞的主要原因，进一步研究发现突变基因不限于此[3]，OHSt还与RhAG、SLC4A1、SLC2A1基因突变有关。

1．RhAG基因突变：RhAG基因编码的Rh相关糖蛋白，在红细胞中与Rh蛋白一起携带D和CE抗原系统，形成Rh复合物——包括糖蛋白B、CD47、细胞黏附分子和带3蛋白。Rh复合物通过CD47-4.2蛋白相互作用，间接与红细胞骨架作用，可以将NH₃和CO₂转运到红细胞中，也可以转运NH₄⁺。RhAG最早的功能研究，是发现RhAG与一价铵转运蛋白Mep/Amt家族序列有显著的相似性，通过酵母突变体的互补研究和注射RhAG cRNA的非洲爪蟾卵母细胞对铵类似物（甲基铵）的摄取，证明了RhAG介导铵的转运。目前研究发现，RhAG中两种突变与OHSt相关：Phe65Ser和Ile61Arg，这些突变导致红细胞体积膨胀和MCHC降低，在37 °C时大量的Na⁺和K⁺渗漏。突变型RhAG蛋白在爪蟾卵母细胞的表达高于野生型，阳离子通透性增加，表明RhAG蛋白诱导阳离子通道功能性增加[11]。

2．SLC4A1基因突变：SLC4A1基因编码带3蛋白。红细胞中最丰富的膜蛋白是带3蛋白，生理条件下，通过电中性机制交换Cl⁻和HCO⁻，参与红细胞气体运输。此前，SLC4A1突变多在遗传性球形红细胞增多症中被发现；2005年研究发现SLC4A1突变影响SLC4A1在质膜中的表达，细胞骨架和质膜之间丧失连接，从而导致结构缺陷，单价阳离子泄漏[13]。多数情况下，SLC4A1突变位于蛋白质转运位点附近，可通过以下方式改变蛋白质的转运特性：将阴离子转化为非选择性阳离子转运体，可驱散Na⁺和K⁺梯度；或者在仍然工作的阴离子转运体中诱导阳离子电导。OHSt与SLC4A1 Arg730Cys突变有关[14]。报道1例DHSt伴红细胞生成障碍患者SLC4A1突变位点为Gly796Arg，将带3蛋白从阴离子转运体突变为阳离子转运体[11]。

3．SLC2A1基因突变：SLC2A1基因编码的促葡萄糖转运体GLUT1是分布最广的葡萄糖转运蛋白，GLUT1与气孔蛋白结合，在红细胞和其他组织中能转化为左旋去氢抗坏血酸转运蛋白。已报道三种突变型：缺失12个核苷酸导致跨膜转运蛋白第7螺旋中Gln282_Ser285del缺失、同一螺旋中Gly286Asp替代及缺失3个核苷酸导致Ile436del。Gln282_Ser285del可见红细胞呈棘球形，后两者均可观察到口形红细胞[14]。这些突变均使Na⁺和K⁺从GLUT1泄漏，降低葡萄糖转运，表现为中度溶血性贫血。Gly286的缺失可降低蛋白质的构象迁移率，改变葡萄糖与残基Gln282和Gln283的配位[15]。同时，气孔蛋白与GLUT1和带3蛋白形成复合物，作为调节转运蛋白活性的骨架蛋白，存在于红细胞中。

（二）DHSt

目前发现与DHSt相关的基因是PIEZO1、KCNN4。PIEZO1基因编码压力感受型机械敏感离子通道1。KCNN4基因编码钾钙激活通道亚家族N成员4，构成Gardos通道。

1．PIEZO1基因突变：属于压力激活阳离子选择性通道，转运所有单价阳离子（如Na⁺、K⁺、Li⁺、Cs⁺）以及二价阳离子（如Ba²⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Mn²⁺）。PIEZO1是迄今为止红细胞膜上最大的离子通道之一，调节人红细胞ATP的机械传导[16]。目前报道的PIEZO1突变大多为错义突变，其中Leu2495_Glu2496dup、Arg2456His和Thr2127Met占所有DHSt患者突变基因的50%以上。突变的位点使得PIEZO通道活性增强、失活减弱，通道长时间打开，导致K⁺外流增多，细胞失水[17]。

2．KCNN4基因突变：KCNN4编码的Gardos通道属于电导Ca²⁺依赖性K⁺通道，广泛表达于红细胞膜上。Gardos通道由KCNN4编码的4个相同的亚单位组成，有6个跨膜结构域。在细胞中参与生理和病理机制，如活化的T细胞和B细胞、巨噬细胞、小胶质细胞、血管内皮细胞和上皮细胞，因此，它被认为是镰状细胞性贫血、哮喘、动脉粥样硬化、肾纤维化和自身免疫等各种疾病治疗的潜在靶点。虽然在成熟的正常红细胞中的功能还未完全阐明，但普遍认为是红细胞体积变化的主要因素之一[18]。稳态时Gardos通道不开放；在外界压力刺激下，细胞内Ca²⁺增加，与钙调蛋白分子相互作用，钙调蛋白分子紧密结合在Gardos通道的四个亚单位上。钙调蛋白和Ca²⁺之间的相互作用导致通道打开，快速的K⁺和水流出导致红细胞脱水、收缩，这种机制被称为“Gardos效应”。在DHSt中，Gardos通道对Ca²⁺激活更敏感，持续保持通道开放和活跃，导致K⁺流出量增加、红细胞过度脱水[19]–[20]。

PIEZO1或Gardos通道的过度激活均导致红细胞脱水，推测这两种通道在压力刺激下共同开放，导致红细胞体积缩小，很可能是PIEZO1相关基因突变导致细胞内Ca²⁺水平增加，随后激活Gardos通道。但是，PIEZO1对K⁺的选择性大于对Ca²⁺的选择性，PIEZO1相关的基因突变使得通道导电状态激活，通过PIEZO1增加K⁺泄漏，与Ca²⁺依赖的Gardos通道的激活无关。因此需进一步研究PIEZO1的离子选择性与红细胞脱水的相关性[19]–[20]。

（三）CHC

CHC由SLC4A1基因错义突变引起，编码带3蛋白，位于阴离子交换蛋白区域。与HSt相关的SLC4A1突变不同，CHC相关的SLC4A1突变是“功能增益”突变。据报道SLC4A1三个位点Ser731Pro、His734Arg和Ser762Arg的错义突变可导致CHC，突变使得带3蛋白阴离子交换功能失活，导致低温时阳离子泄漏增加[14]。SLC2A1突变（Gly286Asp和Ile436del）也可导致CHC[11]。

（四）FP

FP与ABCB6基因突变有关，ABCB6基因编码ATP结合亚家族转运蛋白（ABC），在人体组织中广泛表达。ABC转运体结合ATP转运细胞膜上的内源性和外源性底物。ABCB6作为ABC转运蛋白B亚家族（MDR/TAP）的成员，可以形成同源二聚体，最著名的是作为耐药基因。ABCB6表达上调与多种细胞系耐药性的增强相关。2005年，Weber首次在斑马鱼的基因表达谱中揭示了红细胞中的ABCB6。ABCB6携带Lan（Langereis）血型抗原系统，无症状的Lan（–/–）携带者虽有基因突变，但均为表型正常的红细胞。Lan血型不匹配会引起新生儿溶血性输血反应和溶血性疾病。据Kiss研究，ABCB6是红细胞成熟最后阶段从网织红细胞释放的糖蛋白。ABCB6在红系分化中表达上调，在分化过程中位于成熟红细胞和CD341的质膜上。ABCB6首次功能性研究表明，在HEK-293细胞的体外FP模型中，突变的ABCB6比野生型导致阳离子流量增加[7]。

四、小结

HSt研究远不如遗传性球形红细胞增多症深入，仍有诸多问题有待探讨。诊断方面，形态学上有些HSt口形细胞数量并不多而且形态不典型如DHSt，许多非HSt疾病也会出现一定数量的口形细胞，鉴别诊断HSt需要开发更加便利操作的精准诊断方法。治疗方面，国外治疗指南不建议脾切除治疗，认为术后血栓风险明显比HS风险高；我们临床观察，有些HSt患者在脾脏仅为中轻度增大时就会伴有血小板明显下降，HSt与出凝血/血栓的相关原因值得关注与研究。病理机制研究方面有更多需要探讨的问题，诸如红细胞膜单价阳离子转运组合、电生理的门控机制、上下游离子通道之间调控机制、参与调控的膜蛋白组成与脂筏动态变动、突变体空间构象变化与致病性不一致等问题。

Funding Statement

基金项目：国家自然科学基金（31070734、81570185、81970165）；上海市科委基础研究重点项目（09JC1400100）