Abstract
目的
探讨内皮细胞微粒(EMPs)在过敏性紫癜患儿中的表达及意义。
方法
100例初治过敏性紫癜患儿分为紫癜性肾炎组(HSPN组，40例)和非肾炎组(60例)，并以30例健康体检儿童为对照组。采用流式细胞术或ELISA方法检测各组血清EMPs、Th17及IL-17的表达或含量。
结果
Th17及IL-17在HSP的肾炎组和非肾炎组均高于对照组，以HSPN组最高，差异有统计学意义(P < 0.05)。HSP肾炎组和非肾炎组的EMPs水平较对照组升高，以HSPN组最高，差异有统计学意义(P < 0.05)。紫癜性肾炎组的Th17、IL-17水平与EMPs水平呈正相关(r=0.830、0.644，P < 0.05)。
结论
EMPs在过敏性紫癜的发病机制中起一定作用，EMPs升高可能是过敏性紫癜患儿肾脏受累的原因之一。
Keywords: 内皮细胞微粒, 过敏性紫癜, 紫癜性肾炎, 儿童
Abstract
Objective
To study the expression and significance of endothelial microparticles (EMPs) in children with Henoch-Schönlein purpura (HSP).
Methods
A total of 100 previously untreated children with HSP were classified to Henoch-Schönlein purpura nephritis (HSPN) group (n=40) and non-nephritis group (n=60).Thirty healthy children who underwent physical examination were enrolled as control group.Serum levels of EMPs, T helper 17 cells (Th17), and interleukin-17 (IL-17) were compared between groups.
Results
The HSPN and non-nephritis groups had significantly higher levels of Th17 and IL-17 than the control group, and the HSPN group had the highest levels (P < 0.05).The HSPN and non-nephritis groups had a significantly higher level of EMPs than the control group, and the HSPN group had the highest level (P < 0.05).In the HSPN group, the levels of Th17 and IL-17 were positively correlated with the level of EMPs (r=0.830 and 0.644 respectively; P < 0.05).
Conclusions
EMPs play an important role in the pathogenesis of HSP.The increase in EMPs might be one of the reasons for renal involvement in children with HSP.
Keywords: Endothelial microparticle, Henoch-Schönlein purpura, Henoch-Schönlein purpura nephritis, Child
过敏性紫癜(Henoch-Schönlein, HSP)是一种由免疫复合物介导的小血管炎，儿童较常见，常表现为皮肤对称性紫癜，部分伴有腹痛、消化道出血、关节疼痛、肾脏损害等，其中紫癜性肾炎(Henoch-Schönlein purpura nephritis, HSPN)是最常见的一种继发性肾脏病，影响过敏性紫癜的发展及预后。HSP的血管损伤机制尚不完全清楚，近年研究发现，内皮细胞损伤在HSP的发病机制中起重要作用[1]。内皮细胞微粒(endothelial microparticles, EMPs)是一种直径为0.1~1 µm的小囊泡，由内皮细胞在激活、凋亡或代谢时释放，与动脉硬化、肿瘤及糖尿病等多种疾病的发生发展密切相关[2]。EMPs作为内皮细胞损伤的标志物，目前已成为研究热点，但其与过敏性紫癜的关系却鲜有报道。本研究将健康儿童与HSP患儿的EMPs水平进行比较，探讨EMPs与HSP内皮细胞损伤的相关性，进一步研究HSP内皮细胞损伤的机制，为HSP及HSPN的诊断提供理论依据。
1. 资料与方法
1.1. 研究对象
选取2016年1月至2017年12月在河南省儿童医院初诊并治疗的100例HSP患儿为研究对象，其中尿检异常、经肾穿刺活检符合HSPN诊断的40例，非HSPN的60例。过敏性紫癜诊断参照2006年欧洲风湿病联盟(EULAR)和欧洲儿科风湿病学会(PRES)新标准[3]。HSPN诊断参照2009年中华医学会儿科学分会肾脏病学组制定的紫癜性肾炎诊断标准[4]。并以同年龄段我院门诊体检的健康儿童30例为对照组。100例HSP患儿的平均年龄4.9±2.1岁。对照组平均年龄4.6±1.8岁。HSPN、非HSPN及对照组三组间的年龄差异均无统计学意义(F=0.834，P > 0.05)。
研究获得医院医学伦理委员会批准以及患儿家长知情同意。
1.2. EMPs测定
所有研究对象在治疗前取空腹静脉血5 mL(枸櫞酸钠抗凝)，160 rpm离心10 min，取上清180 rpm离心10 min，取上清得到贫血小板血浆(platelets-free plasma, PFP)，分装后-80℃冰箱保存。
EMPs测定参照文献[5]：37℃水浴箱中溶解PFP样本，4℃下1 500 rpm离心30 min，弃去上清，取50 μL沉淀，加入特异性荧光标记抗体(抗CD31-藻红蛋白、抗CD42b-FITC抗体，购自美国BD公司)10 μL，室温避光孵育30 min，加入1 mL PBS待流式细胞仪检测。标本上机前用直径1.0 μm的标准微球进行前向角设门，使门内的微颗粒直径 < 1.0 μm，然后将标本混匀上机检测，收集门内微颗粒进一步行FITC和PE荧光强度分析。EMPs定义为直径 < 1.0 μm且CD31+/CD42b-。每个样本收集10 000个微粒，获得CD31+/CD42b-EMPs的含量。
1.3. Th17细胞含量及血清IL-17水平测定
所有研究对象在治疗前采集空腹静脉血2 mL(肝素钠抗凝)，采用流式细胞术三色荧光标记法检测Th17细胞(CD3+CD8-IL-17+细胞)含量，CD3-FITC、CD8-PerCP、IL-17-PE抗体来自美国BD Bioscience公司。采用ELISA方法检测血清IL-17水平，试剂盒购自德国QIAGen公司。
1.4. 统计学分析
应用SPSS 22.0进行数据处理。正态分布的计量资料采用均数±标准差(x±s)表示，多组间比较采用单因素方差分析，多组间两两比较采用SNK-q检验。两个变量的相关性分析采用Perason直线相关性分析。P < 0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1. 3组间Th17、IL-17及EMPs水平比较
Th17、IL-17在HSPN及非HSPN组均高于对照组，以HSPN组最高，差异有统计学意义(P < 0.05)；HSPN及非HSPN患儿的EMPs水平较健康对照组升高，以HSPN组最高，差异有统计学意义(P < 0.05)。见表 1。
1.
3组间Th17、IL-17及内皮细胞微粒水平比较(x±s)
| 组别 | 例数 | Th17 (%) |
IL-17 (ng/mL) |
EMPs (%) |
| 注：[HSPN]紫癜性肾炎。a示与对照组比较，P < 0.05；b示与非HSPN组比较，P < 0.05。 | ||||
| 对照组 | 30 | 0.7±0.3 | 13±4 | 5.2±1.7 |
| 非HSPN组 | 60 | 1.3±0.2a | 19±5a | 11.0±2.6a |
| HSPN组 | 40 | 1.6±0.5a, b | 29±6a, b | 15.2±3.9a, b |
| F值 | 28.771 | 160.429 | 327.849 | |
| P值 | < 0.001 | < 0.001 | 0.003 | |
2.2. HSPN患儿的Th17、IL-17水平与EMPs的相关性分析
HSPN患儿的Th17、IL-17水平与EMPs水平呈正相关(r=0.830、0.644，P < 0.05)，见图 1、2。
1.
紫癜性肾炎患儿的Th17水平与内皮细胞微粒水平的相关性分析
2.
紫癜性肾炎患儿的IL-17水平与内皮细胞微粒水平的相关性分析
3. 讨论
中性粒细胞浸润、内皮细胞损伤是过敏性紫癜的重要病理生理基础[6]。内皮细胞损伤可释放大量促炎因子、内皮细胞微粒(EMPs)及黏附分子等，进一步诱导内皮损伤、促进炎症反应。
内皮细胞微粒(EMPs)是由活化或凋亡的血管内皮细胞释放的小囊泡，EMPs促进IL-6及IL-17释放，而炎性因子又诱导EMPs产生[7]。EMPs损伤血管内皮细胞的机制包括：(1)一氧化氮(nitric oxide, NO)是内皮细胞性血管舒张因子，而EMPs可抑制内皮细胞释放NO，降低由乙酰胆碱介导的血管舒张功能，导致内皮细胞功能损伤[8]。(2)EMPs促进内皮细胞损伤处的血小板聚集形成微血栓，促进血管内皮细胞损伤；(3)EMPs影响T淋巴细胞活化及其功能。有研究[9]发现，高浓度EMPs干预组的CD69表达水平较高，而CD69是T细胞活化早期表达的蛋白。EMPs还可诱导TH1型细胞因子分泌如IFN-γ和IL-2，而IFN-γ和IL-2的表达增加又可促进Th细胞的增殖及分化[10]。Th细胞的过度活化进一步激活B淋巴细胞，导致免疫功能紊乱。
有研究[11]表明，EMPs在白塞病、脑血管疾病、急性冠脉损伤综合征、慢性肾病等均有明显升高。这些疾病均有不同程度的血管内皮细胞损伤，而血管内皮细胞损伤也是过敏性紫癜的重要病理生理基础。EMPs在过敏性紫癜患儿中的表达及其意义尚不清楚。本研究发现，EMPs在HSP的肾炎和非肾炎患儿中均明显升高，提示EMPs在过敏性紫癜的发病机制中可能起一定作用。而且HSP患儿的IL-17较对照组升高，提示EMPs可以促进IL-6、IL-17等炎性因子释放，与文献研究一致。结果还表明，过敏性紫癜有肾损伤患儿的EMPs、IL-17更高，提示升高的EMPs可能是过敏性紫癜患儿肾脏受累的原因之一。
免疫机制紊乱在HSP发生发展中占重要地位。本研究HSPN组的EMPs与Th17及IL-17表达均呈正相关，提示EMPs可能诱导Th17活化，刺激机体产生IL-17。与文献报道一致。另有研究[12]表明，Th17细胞及其分泌的IL-17在HSPN的表达高于无肾脏受累的HSP患儿。本研究的Th17、IL-17水平也是以HSPN组最高。
综上所述，EMPs在过敏性紫癜的发病机制中起一定作用，升高的EMPs可能是过敏性紫癜患儿肾脏受累的原因之一。
Biography
付书琴, 女, 硕士, 住院医师
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