微小残留病变检测在儿童急性白血病中的应用

Abstract

近年来，儿童急性白血病（AL）治疗效果随化疗方案的改进和危险分层治疗的引入取得很大进展。但微小残留病变（MRD）仍然是影响AL预后的一大难题。MRD水平影响化疗方案的选择、复发风险的分级，同时还可用于判断预后。目前检测MRD的方法主要有流式细胞术（FCM）和PCR。随着二代测序技术（NGS）的不断成熟与发展，其在MRD检测尤其在干细胞移植（SCT）后MRD检测方面扮演着重要角色。本文对微小残留病变检测在儿童急性白血病中的应用进行综述。

急性白血病（acute leukemia, AL）是儿童时期最常见的肿瘤之一，分为急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leukaemia, ALL）和急性髓系白血病（acute myeloid leukemia, AML）两大类^[1-4]。AL诊断时体内白血病细胞总数约10¹²，诱导化疗达到完全缓解后，白血病细胞总数 < 10⁹，这种体内残存的少量白血病细胞称为白血病微小残留病变（minimal residual disease, MRD）。MRD不能通过形态学方法检测，复发亦或是干细胞移植（stem cell transplantation, SCT）前后，MRD水平均可作为强有力的预后判断因素^[5-6]。而早期治疗反应主要利用形态学予以评估，反映白血病细胞对化疗的敏感性^[7-8]。目前，MRD在ALL和AML中都得到广泛地应用^[9]。SCT是高危/复发AL患儿的治疗选择之一，在可检测到MRD的患儿中，SCT后复发风险较高^{[2, 10]}。因此，MRD可作为AL的独立预后因素，还可在骨髓细胞学改变之前判断复发及评估SCT前白血病疾病负担^{[7, 11]}。目前MRD常用检测方法有流式细胞术（flow cytometry, FCM）和PCR；二代测序（next-generation sequencing, NGS）在MRD检测方面得到进一步应用，但成本较高，也缺乏大宗数据，临床应用有限。

1. 检测方法

在ALL患者中，当MRD≥10^-4时，FCM和PCR的检测效力相当^[11-13]。FCM对每单个细胞进行检测，允许识别小亚群，分析速度快、操作简单、价格便宜，应用更广泛。但FCM分析往往需要很专业的知识，而PCR结果相对容易标准化、易解读^{[5, 12]}。FCM检测MRD主要通过基因融合、突变、过度表达的转录本和ALL白血病相关免疫表型（leukemia associated immunophenotype, LAIP）获得^{[3, 12]}。四色FCM可检测到95%患者的白血病免疫表型，50%的患者敏感度可达10^-4。随着多参数流式细胞术不断发展，采用FCM检测MRD几乎适用于所有AML病例^{[3, 14]}。尽管PCR检测AML患者MRD的灵敏度高，可达10^-4~10^-6，但仅40%的患者具有适合的基因标记，如AML1-ETO、CBFB-MYH11或MLL重组基因产物等，限制了应用^[14-15]。

1.1. FCM

FCM检测MRD的原理是利用白血病细胞异常免疫表型与正常细胞的区别，检测LAIP及这些异常免疫表型光散射特性，敏感性在10^-4~10^-5之间^{[3, 14, 16-17]}。ALL白血病细胞可通过单克隆抗体与FCM可视化的独特细胞标志物结合而被识别^[18]。检测AML患者MRD的免疫标记包括CD34、CD117或CD33，联合一种髓系抗原（CD33或CD13）和/或HLA-DR。目前，LAIP评判包括抗原表达不同步、增强或减少、缺失以及跨系抗原表达等^[17]。

多色FCM是检测ALL-MRD的方法之一，灵敏度达10^-4~10^{-5 [18]}。三色FCM和四色FCM的引进改善了FCM-MRD的灵敏性和适用性^[19]。三色FCM仅在约60%的ALL患者中检测到异常免疫表型，而四色FCM及新的标记物（如CD58/CD49）使用后，FCM-MRD的适用性 > 90%^[5-6]。目前已扩展到6~9色标记，大大提高了MRD检测的灵敏度、准确度及适用性^{[5, 19-20]}。多色标记为白血病细胞免疫表型提供综合性描述，降低了识别难度^{[12, 21]}。

LAIP主要分为3类，第1类是融合基因表达的融合蛋白，如ETV6-RUNX1、TCF3-PBX1和BCR-ABL1，但目前缺乏适用于FCM检测的抗体。第2类是幼稚T细胞免疫表型。由于正常幼稚T淋巴细胞只存在胸腺中，且T-ALL白血病细胞在骨髓和外周血中的分布均匀^[3]，因此对于T-ALL MRD的检测不必依靠异常免疫表型的识别，只要在骨髓或外周血中发现表达幼稚T细胞表型的细胞即可确认为T-ALL细胞。用于T-ALL MRD检测最常用的免疫表型组合为同时表达末端脱氧核苷酸转移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase, TdT）与CD3；或同时表达TdT与CD5^[22]，以上表型组合也可作为T细胞淋巴瘤侵犯骨髓的标志。第3类LAIP只见于B-ALL。B-ALL MRD检测远比T-ALL复杂，主要依靠异于正常前体B淋巴细胞的LAIP ^{[6, 23]}。随着新指标的不断发现，FCM检测LAIPs几乎可以覆盖所有ALL ^[18]。

1.2. PCR

ALL患者使用PCR检测MRD时，常选择免疫球蛋白（Ig）和/或T细胞受体（T cell receptor, TCR）基因重排序列作为标志。ALL白血病细胞是从单个早期病变淋巴细胞发展而来，因此大多数具有克隆性Ig基因和/或TCR基因重排，约90%儿童ALL患者存在适于MRD检测的重排基因，该方法敏感性达10^{-4 [5, 12, 23]}。白血病细胞重排的Ig/TCR基因V（D）J结合部序列具有白血病克隆特异性，与正常淋巴细胞结合部序列不同，而非淋巴细胞无Ig/TCR基因重排。融合基因（如BCR-ABL1、MLLAFF1、TCF3-PBX1及ETV6-RUNX1等）及其mRNA转录本可作为ALL白血病细胞区别于正常细胞的分子标志，但仅约40%的ALL患者具有融合基因, 应用较局限^{[5, 12, 23]}。

在AML患者中，约40%可检测到融合基因转录本如RUNX1-RUNX1T1（AML1-ETO）、CBFβ/MYH11和MLL基因重排，灵敏度达10^-4；FLT3内部串联重复突变及RAS突变也可作为MRD检测靶点，但易产生假阴性；NPM1基因突变也可作为PCR检测靶点，和Ig及TCR基因重排一样仅在10%AML患者中检测到，因此应用过于局限^[24-25]。在AML中WT1基因可过表达，通过PCR检测其水平可作为评估MRD的选择，但儿童AML WT1基因过表达的比例和PCR检测的灵敏度有待明确^[3]。目前AML儿童MRD常用检测方法是RQ-PCR，检测异常融合基因转录本，敏感性达10^-6，但融合基因发生率较低，该技术在AML患者中仅有25%应用率^[3]。

1.3. NGS

SCT后B淋巴细胞大量增殖，应用PCR和FCM方法检测ALL患者MRD有假阳性可能，而NGS检测可更精确^{[18-19, 26]}。NGS通过使用一套通用引物，避免了引物设计和测试患者特异性重排的复杂过程，灵敏度接近10^-6，结果更准确^[27]。

Wu等^[28]对儿童B-ALL患者治疗前和治疗29天后均进行FCM和IgH-NGS测序，在98例患者中92例检出IgH重排；所有FCM检测的MRD阳性患者NGS检测也阳性，但68例FCM检测阴性的患者中NGS检测29例阳性并且MRD水平在FCM的灵敏度范围内。Kotrova等^[26]收集两组接受SCT的ALL儿童（30例患者，228例次样本），第一组包括17例在SCT后获得长期CR的患者，而该组患者在SCT后qPCR-MRD检测中至少存在一次阳性（< 0.01%）结果，27例qPCR阳性标本中只有一例被NGS证实为阳性；另一组13名患者SCT后出现复发，15例qPCR-MRD检测阳性标本中10例NGS检测也为阳性（P=0.002）。提示NGS对于SCT后的MRD检测特异性更高。

2. 检测时点

2.1. 儿童ALL-MRD的检测时点

ALL患者通常在诱导缓解治疗期末（end of induction, EOI）和缓解后的不同时间检测MRD^[12]。EOI MRD阴性的患者缓解期较长，因此对于此类患者继续进行多次MRD检测的意义存在争议^[12]。有研究认为EOI和强化治疗期末（end of consolidation, EOC）MRD水平对于ALL患儿预后有很强预测价值^{[2, 11]}。T-ALL患者，血液或骨髓的MRD对于预后均有指导意义；而B-ALL仅早期（第8天）外周血MRD水平对结局具有预测意义^[11-12]。有研究报道：EOI（33 d）MRD水平对B-ALL预后判断更有价值，而EOC（78 d）MRD水平对T-ALL预后判断更有意义^[29-30]。目前针对ALL-MRD检测时点尚无共识。

2.2. 儿童AML-MRD的检测时点

关于AML-MRD检测时点的研究相对较少。有研究认为，AML患者最佳MRD检测时点是诱导缓解治疗后，可识别出不良反应者和需要移植的患者^[12]。关于AML MRD检测时点的选择需要多中心研究进一步明确。

3. MRD检测对预后判断的价值

3.1. MRD检测对ALL预后判断的价值

MRD为ALL患儿危险分层提供了重要依据。与基于骨髓形态学的早期反应评估相比，MRD提供更加精准的预后预测，对治疗方案的选择也具有决定性价值。近来，MRD评估在很大程度上取代了形态学评估在风险分组中的应用^[30]。

MRD是儿童ALL有力的独立预后因素，对预测初发ALL患者预后及首次复发后诱导方案的选择有重要价值。Vora等^[31]研究表明，依据MRD水平确定的风险状况是与预后相关的独立因素，MRD低风险组5年累计复发率为4.0%，MRD高风险组则为15.0%。徐瑞琴等^[4]研究表明，62例ALL患者中，MRD > 10^-3者复发高于MRD≤10^-3者，而复发率与性别、年龄、是否为难治性无关；不论ALL还是AML，MRD≥10^-2患者的复发早于MRD≤5×10^-3和5×10^-3 < MRD < 10^-2。可见MRD水平与ALL患者复发、及复发时点等高度相关。

在ALL患者中，EOI MRD阴性患者的复发率微乎其微，而EOI MRD > 10^-4患者的复发率超过20%^[31]。Pui等^[32]研究表明，诱导缓解第19天MRD≥1%的患者与更低水平MRD患者相比，10年EFS显著下降；12名第19天MRD≥1%、但第46天转阴的低风险组患者的10年EFS高于第46天未转阴者；而第19天MRD低于1%的患者，无论第46天MRD水平如何，都有较好的预后。

Eckert等^[33]发现，在诱导缓解期和强化期以10^-4、10^-3或10^-2 3个临界点定义MRD，以10^-3作为MRD临界点可更好地预测ALL预后。

3.2. MRD对AML预后判断的临床价值

近40年来，随着AML治疗的不断改进，80%患者达到长期存活，但复发仍有很大比例^{[14, 34]}。近年来研究证实，骨髓中白血病细胞的动态削减和MRD水平可用于判断AML患者预后，评估复发风险。Karol等^[35]研究表明，诱导缓解Ⅰ期后，MRD阴性患者的5年DFS和OS高于MRD阳性患者；Ⅱ期诱导缓解治疗后，MRD阴性患者的5年DFS优于MRD阳性患者。徐瑞琴等^[4]研究表明，不论性别、年龄、难治性，诱导期末MRD > 10^-3者复发多于MRD≤10^-3者。

3.3. MRD对于SCT患者预后判断的临床价值

SCT是复发/难治AL患者治疗方案之一，但复发仍是影响生存率的主要因素^[36]。移植前MRD持续存在或高水平是预后不良的危险因素^{[12, 26, 33]}。MRD检测在成人SCT应用于以下方面：检测移植物中有无MRD来评估骨髓、外周血的净化程度，移植前后动态检测MRD以判断预后^[37]。但MRD在儿童SCT的临床研究尚少。

3.3.1. SCT前MRD水平对预后的影响

SCT前MRD水平对ALL患者预后的影响大于AML患者^{[36, 38-39]}。Eckert等^[33]选用10^-3作为MRD临界点，将SCT前MRD > 10^-3判断为持续存在，发现SCT前MRD持续存在患者的DFS和OS较低，而且遭遇后续事件的概率较高。Gandemer等^[10]报道，在儿童ALLSCT患者中，SCT前MRD≥10^-3是OS的独立影响因素。SCT前MRD水平对SCT后复发、OS、DFS等均有预示作用。Umeda等^[36]发现，ALL患者SCT前MRD阴性组的3年DFS和OS高于MRD阳性组、累积复发率较低；而AML患者的3年DFS、OS和累积复发率在SCT前MRD阳性或阴性组之间的差异无统计学意义。

3.3.2. SCT后MRD水平对预后的影响

目前对于SCT后MRD的预后价值存在争议。BMT报道，21例移植后患者中11例经RQ-PCR检测出MRD阳性，但随访（最少随访1年，平均46个月）中该组患者并无复发与恶化，分析MRD阳性的原因是生理性淋巴细胞的非特异性增殖^{[19, 40]}。也有研究表明，与移植后MRD阴性患者相比，移植后MRD阳性患者预后均较差^[19]。Bernal等^[41]根据SCT后100天的MRD水平将AML或骨髓异常增生综合征患者分组，发现MRD阳性患者的2年累积复发率高于MRD阴性患者；2年EFS、OS较低。

4. 总结及展望

目前大多数AL患儿能够达到长期存活，但仍有复发风险，复发主要与MRD有关。ALL或AML患者的MRD由阴性转为阳性或者MRD水平进一步升高提示复发可能性大^[12]。目前ALL已建立较完善的MRD监测体系，而监测AML-MRD的标准依然需多中心研究来进一步确定。SCT是复发/难治AL患者的主要治疗方法，但移植后复发仍是最大困扰，SCT前MRD水平对移植后预后判断有重要价值，但SCT后由于供者白细胞大量增殖限制了MRD的预测价值。NGS技术已用于MRD检测，特异度和灵敏度较FCM、PCR更高，对于SCT后的MRD检测价值更大。希望MRD检测方法不断进步，提高灵敏度和特异性，为临床服务。

Biographies

程艳芹，女，硕士研究生

ZHAI Xiao-Wen，Email: zhaoxiaowendy@163.com

Funding Statement

上海市科委重大课题子课题（14411950603）