Abstract
目的
探讨早发型腓骨肌萎缩症（CMT）的临床特征及遗传变异分析。
方法
以临床诊断为早发型CMT的患儿为研究对象，收集相关临床资料，进行肌电图及CMT相关基因检测并分析。
结果
早发型CMT病例共13例，男9例（69%），女4例（31%），平均就诊年龄4.0±2.1岁，其中12例（92%）患儿起病年龄 < 2岁。9例（69%）诊断为CMT1型（其中Dejerine-Sottas综合征6人），1例（8%）为中间型，3例（23%）为CMT2型。13例患儿的基因检测结果显示6例（46%）患儿存在外周髓鞘蛋白22（PMP22）基因重复突变、3例（23%）髓鞘蛋白零（MPZ）基因插入突变及点突变、3例（23%）线粒体融合蛋白2（MFN2）基因点突变、1例（8%）人轻肽神经丝蛋白（NEFL）基因点突变，其中11例（85%）为已知致病突变，2例（15%）为新变异。MPZ基因新变异c.394C > G（p.P132A）评级为"可能致病的"及MFN2基因新变异c.326A > G（p.K109R）评级为"致病的"。
结论
早发型CMT以PMP22基因重复突变及MPZ基因突变为主，临床分型以CMT1型为主，其中Dejerine-Sottas综合征占有相当比例。
Keywords: 腓骨肌萎缩症, 外周髓鞘蛋白22基因, 髓鞘蛋白零基因, 线粒体融合蛋白2基因, 人轻肽神经丝蛋白基因, 高通量测序, 儿童
Abstract
Objective
To study the clinical characteristics and genetic variation of early-onset Charcot-Marie-Tooth disease (CMT).
Methods
Children with a clinical diagnosis of early-onset CMT were selected for the study. Relevant clinical data were collected, and electromyogram and CMT-related gene detection were performed and analyzed.
Results
A total of 13 cases of early-onset CMT were enrolled, including 9 males (69%) and 4 females (31%). The mean age at consultation was 4.0±2.1 years. Among them, 12 children (92%) had an age of onset less than 2 years, 9 children (69%) were diagnosed with CMT type 1 (including 6 cases of Dejerine-Sottas syndrome), 1 child (8%) with intermediate form of CMT, and 3 children (23%) with CMT type 2. The genetic test results of these 13 children showed 6 cases (46%) of PMP22 duplication mutation, 3 cases (23%) of MPZ gene insertion mutation and point mutation, 3 cases (23%) of MFN2 gene point mutation, and 1 case (8%) of NEFL gene point mutation. Eleven cases (85%) carried known pathogenic mutations and 2 cases (15%) had novel mutations. The new variant c.394C > G (p.P132A) of the MPZ gene was rated as "possibly pathogenic" and the new variant c.326A > G (p.K109R) of the MFN2 gene was rated as "pathogenic".
Conclusions
Early-onset CMT is mainly caused by PMP22 gene duplication mutation and MPZ gene mutations. The clinical phenotype is mainly CMT type 1, among which Dejerine-Sottas syndrome accounts for a considerable proportion.
Keywords: Charcot-Marie-Tooth disease, PMP22 gene, MPZ gene, MFN2 gene, NEFL gene, High-throughput sequencing, Child
腓骨肌萎缩症（Charcot-Marie-Tooth disease, CMT），又称遗传性运动感觉神经病（hereditary motor and sensory neuropathy, HMSN），是一组具有高度临床和遗传异质性的周围神经单基因遗传病，发病率约为1/2 500[1]。CMT的遗传模式有常染色体显性遗传、常染色体隐性遗传及X-连锁遗传。目前发现80余个基因的1 000余个突变均可导致CMT的发生[2-3]，其中外周髓鞘蛋白22（peripheral myelin protein 22, PMP22）、间隙连接蛋白β1（gap junction protein beta 1, GJB1）、髓鞘蛋白零（myelin protein zero, MPZ）、线粒体融合蛋白2（mitofusin 2, MFN2）四个基因的突变占总突变的近95%[4]。随着多重连接探针扩增技术（multiplex ligation-dependent probe amplification, MLPA）及二代基因测序技术，如基因panel、全外显子组测序技术等的发展及应用，对于CMT的认识不再局限于传统的临床分型。如何确定突变基因，特别是新变异的致病性，确定基因分型，成为了当今分子诊断的难点所在。而美国医学遗传学与基因组学学会（American College of Medical Genetics and Genomics, ACMG）于2015年重新修订的序列变异解读标准和指南[5]，基于人群数据、计算数据、功能数据、共分离数据等，对基因的变异进行分级，为解读工作提供了指向。本文通过对13例早发型CMT患儿的临床特征、家族史及基因检测结果进行分析，最终确定患儿的基因分型。
1. 资料与方法
1.1. 研究对象
以2014年4月至2018年3月在浙江大学医学院附属儿童医院临床诊断为早发型CMT的13例患儿为研究对象，其中男9例（69%），女4例（31%），其中12例（92%）患儿起病年龄 < 2岁，平均就诊年龄4.0±2.1岁。
对于早发型CMT采用诊断标准[6-7]：（1）发病年龄 < 10岁；（2）慢性起病，缓慢进展的肢体远端尤其是双下肢远端的肌无力和肌萎缩，典型者成鹤腿畸形；（3）肌电图显示周围神经性受损；（4）神经活检证实周围神经损害；（5）家族史阳性；（6）弓形足或脊柱侧凸；（7）排除以下疾病：慢性炎性脱髓鞘性多发性神经根神经病、糖尿病性周围神经病、酒精中毒性周围神经病、周围神经淀粉样变性、进行性脊髓性肌萎缩症、脊髓亚急性联合变性等。
患儿须具备上述第（1）、（2）、（3）、（7）四条及第（4）、（5）、（6）中任何一条。若家族中已有确诊者，再具备第（1）、（2）条即可诊断。
1.2. CMT临床分型
基于神经电生理和病理特点，CMT的临床分型可初步分为（1）脱髓鞘型（CMT1型）：正中神经运动传导速度（motor nerve conduction velocity, MNCV） < 38 m/s，神经活检示显著的节段性脱髓鞘，施万细胞增生，呈“洋葱头”样改变；其中正中神经MNCV < 12 m/s者亦称Dejerine-Sottas综合征（Dejerine-Sottas syndrome, DSS）；（2）轴索型（CMT2型）：正中神经MNCV > 38 m/s，神经活检示慢性轴索变性和再生，有髓纤维减少，神经再生簇形成；（3）中间型：正中神经MNCV介于25~45 m/s，神经病理兼具脱髓鞘和轴索变性特点。
1.3. 资料采集
收集患儿相关临床资料：性别、就诊年龄、起病年龄、起病症状、家族史及神经系统体征。
1.4. 周围神经病相关基因高通量测序
抽取患儿外周静脉血3 mL，放置EDTA抗凝管中，送至北京金准基因科技有限责任公司，采用周围神经病相关106个基因panel检测。发现基因点突变时，根据选取位点的位置用Primer 5设计、合成引物，进行PCR扩增，对高通量测序结果中的变异位点进行Sanger测序验证；发现基因重复突变时，对捕获区域进行覆盖度计算及均一化处理，检测出可能发生拷贝数变异的区域，经MLPA检测基因（主要针对PMP22基因），确认重复范围；对亲属进行Sanger测序突变位点验证，根据家系共分离结果进一步判断其致病性。
应用人类基因突变数据库（HGMD, http://www.hgmd.cf.ac.uk）确认已报道的致病基因位点。对于新变异位点，应用ESP数据库（http://evs.gs.washington.edu/EVS）、千人数据库（http://browser.1000genomes.org）、ExAC数据库（http://exac.broadinstitute.org）进行正常对照人群变异比对，应用ACMG指南标准对新变异进行评级。
2. 结果
2.1. 临床表现
5例（38%）患儿存在运动发育落后，独走年龄 > 18月，伴行走不稳、平衡能力差、易摔倒、步态异常。13例（100%）患儿均存在远端肢体无力，4例（31%）伴远端肢体萎缩，6例（46%）伴上肢受累，1例（8%）伴脊柱侧凸。见表 1。
1.
13例早发型CMT患儿基本信息及临床表现
| 病例 | 性别 | 就诊年龄(岁) | 起病年龄(岁) | 起病症状 | 临床表现 | |||||
| 足畸形 | 远端肢体无力 | 远端肢体萎缩 | 上肢受累 | 感觉症状 | 脊柱侧凸 | |||||
| 注：+示阳性症状；-示阴性症状。 | ||||||||||
| 1 | 女 | 2.3 | < 2 | 20月独走，下肢无力 | 鹤腿 | + | - | - | 未评 | - |
| 2 | 男 | 3.3 | < 2 | 24月独走，下肢无力 | 弓形足 | + | + | + | 未评 | + |
| 3 | 女 | 1.8 | < 2 | 16月独走，步态异常 | 弓形足 | + | - | - | 未评 | - |
| 4 | 男 | 6 | < 2 | 15月独走，步态异常，走路易摔跤 | 弓形足、鹤腿 | + | + | + | + | - |
| 5 | 男 | 5.4 | < 2 | 13月独走，走路易摔跤 | 弓形足、鹤腿 | + | - | - | - | - |
| 6 | 男 | 4 | < 2 | 20月独走，步态异常，走路易摔跤 | 弓形足 | + | - | + | 未评 | - |
| 7 | 男 | 5 | < 2 | 12月独走，步态异常 | 马蹄内翻足 | + | + | - | + | - |
| 8 | 女 | 9 | 8 | 13月独走，8岁出现下肢无力，步态异常 | 弓形足、鹤腿 | + | + | - | + | - |
| 9 | 男 | 4.7 | < 2 | 15月独走，下肢无力 | 弓形足、鹤腿 | + | - | + | 未评 | - |
| 10 | 男 | 1.3 | < 2 | 16月尚不能独走 | 鹤腿 | + | - | + | 未评 | - |
| 11 | 男 | 3.2 | < 2 | 18月独走，步态异常 | 鹤腿 | + | - | - | 未评 | - |
| 12 | 男 | 2.5 | < 2 | 20月独走，上楼梯步态异常 | 鹤腿 | + | - | + | 未评 | - |
| 13 | 女 | 4.2 | < 2 | 12月独走，15月出现步态异常，走路易摔跤 | 弓形足 | + | - | - | 未评 | - |
2.2. 肌电图结果
肌电图显示正中神经MNCV < 25 m/s者9人，介于25~45 m/s者1人，> 45 m/s者3人，可分为CMT1型9人（69%），中间型1人（8%），CMT2型3人（23%）。9例CMT1型患儿中，有6例正中神经MNCV < 12 m/s，即DSS；有5例（病例1、2、4、8、13）正中神经复合肌肉动作电位（compound muscle action potential, cMAP）均降低，提示合并轴索损害；且正中神经感觉神经传导速度（sensory nerve conduction velocity, SNCV）及感觉神经动作电位（sensory nerve action potential, SNAP）均未能引出。见表 2。
2.
13例早发型CMT患儿的肌电图结果
| 病例 | 正中神经 | 临床分型 | |||
| MNCV (m/s) | cMAP (mV) | SNCV (m/s) | SNAP (μV) | ||
| 注：[NP]未引出。 | |||||
| 1 | 4.9 | 0.68 | NP | NP | CMT1/DSS |
| 2 | 8.8 | 0.38 | NP | NP | CMT1/DSS |
| 3 | 9.4 | 1.5 | NP | NP | CMT1/DSS |
| 4 | 9.2 | 0.2 | NP | NP | CMT1/DSS |
| 5 | 51.3 | 2.9 | 51.3 | 9.0 | CMT2 |
| 6 | 25.5 | 2.6 | 30.1 | 1.63 | 中间型CMT |
| 7 | 51.4 | 3.6 | 41.1 | 4.5 | CMT2 |
| 8 | 23.3 | 1.3 | NP | NP | CMT1 |
| 9 | 11.4 | 3.0 | NP | NP | CMT1/DSS |
| 10 | 6.1 | 2.8 | NP | NP | CMT1/DSS |
| 11 | 52.3 | 6.1 | NP | NP | CMT2 |
| 12 | 18.6 | 3.0 | NP | NP | CMT1 |
| 13 | 15.3 | 1.05 | NP | NP | CMT1 |
2.3. 基因诊断
13例患儿的基因检测结果显示11例（85%）为已知致病突变，2例（15%）为新变异，其中5例（38%）存在家族史。突变基因包含PMP22重复突变（6例，46%）、MPZ基因插入突变及点突变（3例，23%）、MFN2基因点突变（3例，23%）及人轻肽神经丝蛋白（NEFL）基因点突变（1例，8%）。2例新变异分别为MPZ基因c.394C > G(p.P132A)及MFN2基因c.326A > G(p.K109R)。见表 3。
3.
13例早发型CMT患儿突变基因、核苷酸及氨基酸改变信息
| 病例 | 临床分型 | 突变基因 | 核苷酸改变 | 氨基酸改变 | 父母有无变异 | 是否为新变异 |
| 1 | CMT1/DSS | MPZ | c.394C > G | p.P132A | 无 | 是 |
| 2 | CMT1/DSS | MPZ | c.90C > G | p.I30M | 无 | 否 |
| 3 | CMT1/DSS | PMP22 | PMP22基因整体重复 | - | 父 | 否 |
| 4 | CMT1/DSS | PMP22 | PMP22基因整体重复 | - | 无 | 否 |
| 5 | CMT2 | MFN2 | c.326A > G | p.K109R | 无 | 是 |
| 6 | 中间型CMT | NEFL | c.293A > G | p.N98S | 无 | 否 |
| 7 | CMT2 | MFN2 | c.280C > T | p.R94W | 无 | 否 |
| 8 | CMT1 | PMP22 | PMP22基因整体重复 | - | 无 | 否 |
| 9 | CMT1/DSS | PMP22 | PMP22基因整体重复 | - | 父 | 否 |
| 10 | CMT1/DSS | MPZ | c.293C > T | p.R98C | 无 | 否 |
| 11 | CMT2 | MFN2 | c.1090C > T | p.R264W | 母 | 否 |
| 12 | CMT1 | PMP22 | PMP22基因整体重复 | - | 母 | 否 |
| 13 | CMT1 | PMP22 | PMP22基因整体重复 | - | 母 | 否 |
2.4. 新变异分析
病例1携带MPZ基因c.394C > G(p.P132A)杂合变异，病例5携带MFN2基因c.326A > G(p.K109R)杂合变异。Sanger测序验证两位患儿的父母均未携带相应变异，该患儿为新发（de novo）变异。两个基因变异位点在哺乳动物中高度保守。见图 1~2。
1.
病例1家系图、Sanger测序图及保守序列分析
图A示病例1家系图，■为先证者，○为健康女性，□为健康男性；图B示MPZ蛋白第132号氨基酸位点在哺乳动物中高度保守；图C示患儿存在MPZ基因c.394C > G(p.P132A)杂合突变，父母在该位点均未携带突变（箭头所示）。
2.
病例5家系图、Sanger测序图及保守序列分析
图A示病例5家系图，■为先证者，○为健康女性，□为健康男性；图B示MFN2蛋白第109号氨基酸位点在哺乳动物中高度保守；图C示患儿存在MFN2基因c.326A > G(p.K109R)杂合突变，父母在该位点均未携带突变（箭头所示）。
应用ACMG序列变异解读标准对2个新变异进行评级。MPZ基因c.394C > G(p.P132A)杂合变异，为新发变异，无家族史，符合PS2；该变异为ESP数据库、千人数据库、ExAC数据库正常对照人群中未发现的变异，符合PM2；SIFT、PolyPhen-2、PROVEAN软件的生物信息数据分析预测提示“有害的”，MutationAssessor预测提示“致病性中等”；因此该变异被判定为“可能致病的”。MFN2基因c.326A > G(p.K109R)杂合变异，也为新发变异，无家族史，符合PS2；MFN2蛋白第107~111号氨基酸为核苷酸结合域，影响GTP的结合[8-9]，符合PS3；该变异为ESP数据库、千人数据库、ExAC数据库正常对照人群中未发现的变异，符合PM2；经SIFT、PolyPhen-2、PROVEAN、MutationAssessor软件的生物信息数据分析预测，均提示为“有害的”，符合PP3；因此该突变被判定为“致病的”。见表 4。
4.
新变异的ACMG致病性分级
| 病例 | 突变基因 | SIFT | PolyPhen-2 | PROVEAN | Mutation-Assessor | ACMG致病性分级 | 致病性判定 | ||
| 强 | 中等 | 支持证据 | |||||||
| 注：-示无支持证据。 | |||||||||
| 1 | MPZ | 0.01 | 0.93 | -6.97 | 2.37 | PS2 | PM2 | - | 可能致病的 |
| 5 | MFN2 | 0 | 1.00 | -2.66 | 4.07 | PS2, PS3 | PM2 | PP3 | 致病的 |
3. 讨论
CMT是一组具有高度临床和遗传异质性的周围神经系统遗传病，诊断需结合临床分型及基因分型。二代测序技术的发展正改变着CMT基因诊断的方式。包含所有已知CMT相关基因的基因panel检测是如今最经济、最高效、最直接的基因检测方式，这能让临床医生在第一时间对所有CMT基因的突变情况有一个整体的了解。它能很好的体现基因型-表型的对应关系，为临床的治疗、随访提供可靠保障。但新变异的临床意义解读是临床工作的一个难点所在。2015年，ACMG提出了适用于所有孟德尔基因变异，包括单基因、多基因包、外显子组和基因组测序发现的遗传变异的解读标准与指南[5]。
本研究共确诊13例早发型CMT患儿，6例（46%）PMP22基因重复突变，3例（23%）MPZ基因点突变，3例（23%）MFN2基因点突变及1例（8%）NEFL基因点突变，这与之前Cornett等[10]报道的CMT患儿前三位的突变基因一致。而对于占总体CMT人群突变第二位的GJB1基因，却并非CMT患儿的主要突变基因。这是由于在脱髓鞘型中，PMP22基因重复突变、MPZ、NEFL基因突变的患者多表现为早发型；而在轴索型中，几乎所有的MFN2基因突变的患者表现为早发型，而GJB1基因突变患者无论表现为脱髓鞘型或轴索型，起病年龄均相对较晚[11]。
本研究中6例患儿起病年龄早，且正中神经MNCV < 12 m/s，符合DSS的诊断标准。突变基因包括3例MPZ基因突变和3例PMP22基因重复突变，与之前文献报道的DSS多数为MPZ及PMP22（包括整体重复及点突变）相一致[12]。近年来，DSS更被看做是一个临床综合征，尽管DSS患儿起病年龄早，且MNCV显著降低，提示着严重的脱髓鞘或者无髓鞘形成，但Gabreëls-Festen等[12]对25例DSS患者进行随访发现，仍有1/3的患者在平均年龄39.9岁时尚可独立行走1 km以上。DSS的出现并非预示着成人期的严重残疾及轮椅依赖的可能。
近年来，多项研究均提示MNCV虽能作为临床分型的主要指标，但却与疾病的进展不相平行。而cMAP尽管与起病年龄不相关，却关乎病程长短及疾病的严重程度，特别是在PMP22基因重复突变及MPZ基因突变的患者中，cMAP与远端肌力密切相关[13-14]。文中CMT1型患儿中有5人cMAP低于同龄儿，表明该型患儿除脱髓鞘病变外尚还存在轴索病变，且也预示着患儿相对预后不良。
综上，本研究依据患儿的临床表现、神经肌肉电生理特征、遗传模式、二代测序结果，结合临床分型及基因分型，采用ACMG标准对新变异致病性进行分析，共确诊早发型CMT 13例，为临床CMT的诊断确定基础。
Biography
徐佳露, 女, 博士, 主治医师
Funding Statement
国家青年科学基金（81501084）
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