黄芩苷对注意缺陷多动障碍大鼠突触体ATP酶和LDH的影响及对AC/cAMP/PKA信号通路的调控作用

Abstract

目的

研究黄芩苷对注意缺陷多动障碍（ADHD）模型大鼠脑突触体腺苷三磷酸（ATP）酶、乳酸脱氢酶（LDH）的影响及对腺苷酸环化酶（AC）/环磷酸腺苷（cAMP）/蛋白激酶A（PKA）信号通路的调控作用。

方法

将40只SHR大鼠随机分为模型组、盐酸哌甲酯组（0.07 mg/mL）、黄芩苷低（3.33 mg/mL）、中（6.67 mg/mL）、高剂量组（10 mg/mL），每组8只，另设WKY大鼠8只为正常对照组。Percoll密度梯度离心法制备脑突触体，电镜观察突触体结构；运用比色法检测突触体ATP酶、LDH活性；运用ELISA法检测突触体内AC、cAMP、PKA的含量。

结果

与正常对照组比较，模型组大鼠脑突触体存在ATP酶活性降低、LDH活性升高及AC、cAMP、PKA含量降低的改变（P < 0.05）。与模型组比较，盐酸哌甲酯及黄芩苷中、高剂量均能显著升高ADHD模型大鼠脑突触体内ATP酶活性（P < 0.05），降低LDH活性（P < 0.05），并显著提高AC、cAMP、PKA含量（P < 0.05）。与盐酸哌甲酯组比较，高剂量黄芩苷治疗ADHD模型大鼠对改善上述各指标水平的效果更为显著（P < 0.05）。与黄芩苷低剂量组比较，黄芩苷高剂量组ATP酶活性显著升高（P < 0.05）；黄芩苷中、高剂量组LDH活性显著降低，AC、cAMP、PKA含量均显著升高（P < 0.05）。与黄芩苷中剂量组比较，黄芩苷高剂量组ATP酶活性显著升高（P < 0.05）。

结论

盐酸哌甲酯及黄芩苷均能改善ADHD模型大鼠脑突触体ATP酶、LDH活性；黄芩苷的作用与剂量存在相关性，且高剂量黄芩苷较盐酸哌甲酯效果更为显著；黄芩苷可能是通过上调AC/cAMP/PKA信号通路发挥治疗作用。

黄芩为唇形科植物黄芩（Scutellaria baicalensis Georgi）的干燥根，在中国拥有数千年的药用植物历史。在传统中药理论中，黄芩是清热燥湿药的代表药，药性苦寒，主归肺、胆、脾、胃、大肠经，具有清热燥湿、泻火解毒、止血、安胎之功效，也因此在临床中广泛应用于炎症性疾病、发热、肝炎、黄疸及高血压等的治疗^[1-3]，在数千年的临床应用中显示了可靠的安全性和稳定的临床疗效。黄芩苷（baicalin）为黄酮类化合物，是中药黄芩的主要有效成分，为淡黄色粉末，无臭，味苦。在现代药物研究中，黄芩苷具有抗癌、抗炎、抗氧化的作用，而黄芩苷对神经系统疾病的影响尚未见报道。

注意缺陷多动障碍（attention deficit hyperactivity disorder, ADHD）又称儿童多动症，是儿童时期常见的精神神经异常性疾病，全球发病率约为5.9%，且有不断上升的趋势^[4]。本病的发病机制尚未明确，多巴胺（dopamine, DA）缺陷理论当前在国际学术界认可度最高^[5]。关于DA缺陷的形成原因，脑内DA转运体（dopamine transporter, DAT）功能的异常在学界已基本形成共识^[6]，而近来的研究中发现，腺苷酸环化酶（AC）/环磷酸腺苷（cAMP）/蛋白激酶A（PKA）通路在脑内DA缺陷的形成及ADHD的发病过程中地位特殊^[7]。研究表明，D2RS被突触间隙DA激活后，能够通过抑制AC/cAMP/PKA通路反馈性地抑制DA合成^[8-9]，使DA的合成速度降低，最终导致脑内DA缺陷状态的形成。AC/cAMP/PKA信号通路的活化情况成为研究DA缺陷及ADHD发病机制的另一重要方向^[10-11]。在DA神经元中，AC/cAMP/PKA通路广泛分布于DA神经元突触体内，同时，作为单胺类递质的DA，其合成、释放及清除的整个过程也需在突触体内完成^[12]，因此，若要精确研究AC/cAMP/PKA信号通路及ADHD发病机制，突触体是不可忽视的一个关键环节^[13]。近期研究发现，黄芩苷能够迅速通过血脑屏障（blood-brain barrier, BBB）且在纹状体、海马内聚集^[14-15]，发挥对DA神经元的保护作用，并能够治疗与DA功能异常相关的神经退行性疾病^[16]。有学者提出DA系统可能是黄芩苷的“脑内靶系统”^[17]。基于以上的研究结论，我们大胆推测黄芩苷可能存在调控脑内DA系统而治疗ADHD的功能，相关假说已在SCI核心期刊发表^[18]。为验证黄芩苷对脑内DA系统的影响及对ADHD治疗作用的假说，作者从AC/cAMP/PKA信号通路着手，在国际公认的ADHD模型自发性高血压大鼠（spontaneously hypertensive rats, SHR）突触体内进行相关实验研究^[19]。通过提取SHR大鼠前额叶、纹状体的突触体，检测突触体的酶活性及突触体内AC、cAMP、PKA的含量，试图从突触水平初步探讨黄芩苷对脑内DA系统的影响及对ADHD的治疗作用，主要实验内容如下。

1. 材料与方法

1.1. 动物分组

SHR大鼠用于ADHD动物模型的建议目前已被国际上公认，是国际上应用最为广泛、研究最多的ADHD动物模型^[20-21]。SHR大鼠起源于东京远交系Wistar大鼠，是Okamoto等^[22]于1963年用Wistar Kyoto（WKY）大鼠经过数代交叉培育出的一个新品种。SHR大鼠起初主要用于高血压病的研究，但在之后的研究中发现SHR大鼠在10周龄之前基本不表现高血压症状，4~10周龄SHR大鼠几乎符合儿童多动症所有临床特征，且该模型易于获得，无需任何人工诱发，且具有天然对照组WKY大鼠，因此4~10周龄SHR大鼠成为目前国际认可度最高的ADHD模型^[23]。

SPF级4周龄雄性SHR大鼠40只，体重73±6 g；SPF级4周龄雄性WKY大鼠8只，体重74±6 g，均购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证编号SCXK（京）2012-0001。所有动物均饲养于南京中医药大学SPF级动物房，使用许可证号：SYXK（苏）2014-0001。按照随机数字表法将SHR大鼠随机分为模型组、盐酸哌甲酯组、黄芩苷低、中、高剂量组，每组8只，WKY大鼠8只设为正常对照组。

1.2. 药品准备

盐酸哌甲酯（专注达，36 mg/片），Janssen Cilag Manufacturing LLC生产，西安杨森制药有限公司分装，进口药品注册证号H20120111，进口准许证号TP120120504。将药品加生理盐水配制成0.07 mg/mL混合液，4℃保存，灌胃前按需取出，复温至室温后灌胃给药。

黄芩苷购自成都菲普斯生物技术有限公司，药物纯度 > 95%（高效液相色谱法，检测波长280 nm）。将药品加生理盐水分别配制成3.33mg/mL（低剂量）、6.67 mg/mL（中剂量）及10 mg/mL（高剂量）的混合液，4℃保存，灌胃前按需取出，复温至室温后灌胃给药，每次灌胃前摇匀。

1.3. 动物给药

大鼠灌胃量根据9岁（体重26 kg）儿童体表面积和4周龄（体重60 g）SHR大鼠体表面积进行转换得出^[24]。各组大鼠适应性喂养3~5 d，然后持续4周灌胃，每日两次（上午8 : 00~9 : 00、下午13 : 30~14 : 30）。每日上午8 : 00灌胃前称量大鼠体重，灌胃量为1.5 mL/100 g。盐酸哌甲酯组及黄芩苷低、中、高剂量组分别按体重给予对应药物灌胃，正常对照组、模型组给予等量生理盐水灌胃。为避免药物颜色不同对动物的影响，所有透明灌胃容器均用白色医用胶带包裹。

1.4. 动物取材

末次给药24 h后断头处死大鼠，冰上迅速分离大鼠前额叶、纹状体，置于冻存管中液氮保存，取材结束后转移至-80℃超低温冰箱保存备用。

1.5. 主要实验设备

Sartorius PB-10 pH调定器（德国Sartorius公司）；Beckman coulter Allegra 64R离心机（美国Beckman coulter公司），F0650 50 mL固定角度转头及RUBBER ADAPTEK TUBES 15 mL橡胶适配套（美国Beckman coulter公司）；Retsch MM400球磨仪（德国Retsch公司）；Eppendorf 5427R离心机（德国Eppendorf公司）；Infinite M200 PRO多功能酶标仪（瑞士TECAN Infinite公司）；日立S-3000N型透射电镜（日本Hitachi公司）。

1.6. 突触体提取

取待检测组大鼠前额叶、纹状体，用大量冰点的均质缓冲液洗去血液等杂质，滤纸吸干后称重，将组织剪碎放入研磨管中研磨，采用Percoll密度梯度离心法制备突触体备用，详细操作步骤参考课题组前期相关实验技术^[25]。

1.7. 突触体结构电镜观察

将提取的突触体，用2.5%戊二醛4℃条件下固定2 h，0.2 mol/L磷酸盐缓冲液（PBS）洗3次，每次10 min，然后换用1%锇酸后固定1 h。按透射电镜常规超薄切片制作方法，进行乙醇梯度脱水、渗透、包埋、聚合、醋酸铀染色、硝酸铅染色，详细步骤按照日立S-3000N型透射电镜切片要求进行操作，观察突触体的结构。

1.8. 检测方法

突触体腺苷三磷酸（ATP）酶、乳酸脱氢酶（LDH）活性检测采用比色法进行，相关试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，比色测定波长分别为636 nm、440 nm，具体操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。突触体中AC、cAMP、PKA含量检测均采用ABC-ELISA法，试剂盒由南京金益柏生物科技有限公司提供，实验步骤按试剂盒操作说明书进行。

1.9. 统计学分析

采用SPSS 19.0统计软件对数据进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验，P < 0.05为差异有统计学意义。

2. 结果

2.1. 突触体结构电镜观察

完整的突触体结构为圆型或椭圆形，外膜完整呈连续封闭状，内含线粒体及大量突触小泡^[26-27]。本实验所获取的突触体形态上呈连续膜封闭的椭圆结构，周围有完整的膜包围；突触前膜可见一个或多个线粒体和大量颗粒状突触小囊泡；突触间隙清晰可见，且突触后膜可见电密度增高影，结构完整，形态清晰，颜色较深。突触体突触前膜、突触间隙、突触后膜保存完好，突触体分布密度较高，具有典型的突触体形态结构特征，如图 1。

1.

电镜下观察突触体形态结构（图A~C×40 000，图D×20 000）

突触体呈椭圆形，分布密度较高，结构完整，可见线粒体（红色箭头所示）及突触小泡（黄色箭头所示），符合相关实验标准要求。

2.2. 突触体内ATP酶、LDH活性测定

与正常对照组相比，模型组大鼠脑突触体ATP酶活性显著降低（P < 0.05），LDH活性显著升高（P < 0.05）；与模型组相比，经给药治疗后，盐酸哌甲酯组及黄芩苷低、中、高剂量组ATP酶活性均显著升高（P < 0.05），除黄芩苷低剂量组外，LDH活性均显著降低（P < 0.05）；与盐酸哌甲酯组比较，黄芩苷中、高剂量组ATP酶活性显著升高（P < 0.05）；与黄芩苷低剂量组比较，黄芩苷高剂量组ATP酶活性显著升高（P < 0.05），黄芩苷中、高剂量组LDH活性显著降低（P < 0.05）；与黄芩苷中剂量组比较，黄芩苷高剂量组ATP酶活性显著升高（P < 0.05）。见表 1。

1.

突触体内ATP酶、LDH活性测定

2.3. 突触体内AC、cAMP、PKA含量检测

与正常对照组相比，模型组大鼠脑突触体内AC、cAMP、PKA含量均显著降低（P < 0.05）；经治疗4周后，与模型组相比，盐酸哌甲酯组及黄芩苷低、中、高剂量组大鼠脑突触体内AC、cAMP、PKA含量均显著升高（P < 0.05）；与盐酸哌甲酯组比较，黄芩苷高剂量组AC含量及黄芩苷中、高剂量组cAMP、PKA含量均显著升高（P < 0.05）；与黄芩苷低剂量组比较，黄芩苷中、高剂量组AC、cAMP、PKA含量均显著升高（P < 0.05）。见表 2。

2.

突触体内AC、cAMP、PKA含量检测

3. 讨论

突触是脑内基本信息加工的节点部位，突触的功能失调应该是许多脑部疾病的基础；突触的功能和分子机制研究或是解开众多脑部疾病复杂原因的途径^[28]。突触体是进行脑部疾病研究的良好标本，保证突触体结构完整性且具有较高的酶活性是进行研究的基础。在实验初始阶段，课题组成员在已经熟练掌握相关实验技术的基础上^[25]，再次进行实验前突触体结构的观察，保证本次实验所用突触体符合严格的实验要求。之后，课题组进行了ATP酶、LDH活性的检测。ATP酶存在于组织细胞及细胞器的膜上，是生物膜的一种蛋白酶，它在物质运送、能量转换以及信息传递方面具有重要的作用。ATP酶存在Na⁺-K⁺-ATP酶及Ca²⁺-ATP酶两种主要功能形式，前者主要通过Na⁺-K⁺泵的作用来维持细胞内外Na⁺、K⁺的平衡；后者则主要通过将细胞内Ca²⁺泵向细胞外及内质网，来维持细胞内Ca²⁺的浓度^[29]。此外，除了细胞内的ATP，在中枢神经系统中存在大量的细胞外ATP，细胞外ATP在中枢神经系统的主要功能不是直接的信息传递，而是间接的调控作用^[30-31]。对于突触体而言，突触体调控DA合成、释放及清除的功能既需要Na⁺-K⁺-ATP酶及Ca²⁺-ATP酶的作用^[12]，也需要细胞外ATP酶的间接调控作用，因此，突触体ATP酶的活性是突触体离子通道活性及间接调控功能强弱的表现，一定程度上代表了突触体的活性。通过实验我们发现，相比正常对照组，模型组大鼠脑突触体ATP酶活性显著降低，表明该模型制备成功；经治疗4周后，与模型组相比，盐酸哌甲酯组及黄芩苷低、中、高剂量组ATP酶活性均显著增高。本实验结果表明，所提取的突触体不仅能够应用于实验研究，且黄芩苷低、中、高剂量均能显著升高ATP酶的活性并具有量效相关性，这提示黄芩苷在提高ATP酶活性上效果明显。

LDH存在于人体各组织器官中，是机体能量代谢中的一种重要酶，LDH质与量的改变，直接影响到机体的能量代谢。在神经药理学研究中，LDH常作为评价脑功能的一项重要指标^[32]。LDH是细胞内酶，少量漏出即提示细胞膜通透性增高，漏出的多少反映细胞膜的受损程度^[33]。LDH广泛存在于脑细胞中，当脑组织缺血、缺氧时，受损脑细胞释放出LDH，导致脑内LDH含量及活性增高^[34]。因此，LDH活性可侧面评价突触体结构完整性及活性^[35]。在本次实验中，模型组及黄芩苷低剂量组大鼠脑突触体LDH活性有所升高，与模型组相比，LDH活性在盐酸哌甲酯组及黄芩苷中、高剂量组中有所降低。这一实验结果表明，ADHD模型大鼠可能存在突触体及脑功能的损伤，而黄芩苷具有改善这一损伤的作用，而这一损伤是否与脑内DA含量的异常及ADHD症状的产生存在关联尚需更深入的实验研究。

黄芩苷虽广泛应用于炎症性疾病、消化系统疾病的临床治疗，但有关黄芩苷对ADHD的临床及实验研究国内外均未见报道。DA神经元主要分布在中脑的红核后区、黑质区及腹侧被盖区，前额叶及纹状体是DA神经元的主要分布区域和功能区域，研究黄芩苷对DA系统的调控作用，前额叶、纹状体的突触体是最好的实验标本。相关研究表明黄芩苷能够迅速通过BBB，进入中枢神经系统，调控前额叶、纹状体的DA含量，改善因DA含量异常而导致的一系列神经系统疾病，如帕金森、老年痴呆等^[36-38]。良好的BBB通透性及迅速的DA调控作用使黄芩苷治疗ADHD成为可能。基于此，作者提取前额叶、纹状体的突触体，测定突触体ATP、LDH的活性，保证了运用突触体进行实验的可行性，并初步检测了具有代表性意义的、由DA自身受体D2RS调控的G蛋白偶联受体信号通路AC/cAMP/PKA。

概括而论，细胞内的信号转导通路主要分为两类，一类是受G蛋白受体偶联第二信使调节的信号通路，另一类则是受到受体偶联调节的信号通路^[39]。多巴胺受体属于G蛋白偶联受体，其受体分为D1样及D2样受体两类，D1R与D2R均为G蛋白偶联受体，具有该受体的基本特征，为7次跨膜的多肽链，氨基端在细胞外，羧基端在细胞内，其主要信号转导机制是通过G蛋白受体偶联第二信使调节细胞内信号转导^[40]。其中，D1R通过G蛋白α亚基的两个亚型Gαs、Gαolf来激活AC，进而引起细胞内cAMP含量上升，cAMP含量的升高，导致依赖性蛋白激酶PKA的进一步活化，从而发挥相应功能；而D2R则与D1R相反，研究表明，D2R短链部分D2RS能够特异性的与G蛋白α亚基抑制性亚基Gαi/o相结合，产生抑制性效应，抑制AC/cAMP/PKA信号通路的表达，降低DA合成限速酶—酪氨酸羟化酶的合成速度，从而降低脑内DA的含量^[41]。故AC的活性及cAMP的表达水平由D1R与D2R共同维持，其中，能否降低D2RS的抑制作用，是调节DA的合成速度，提高脑内DA含量的重要途径。本次研究表明，黄芩苷能够显著增加突触体内AC、cAMP及PKA的含量，且较盐酸哌甲酯组升高更为明显，同时存在量效相关性，进而反馈性的促进DA的合成，降低D2RS的抑制作用。

本次研究是对前期有关黄芩苷治疗ADHD疗效的求证性研究，通过实验研究我们发现，黄芩苷确实存在提高突触体活性，改善突触体功能的作用，并且显著增加突触体内AC、cAMP及PKA的含量，通过降低D2RS对AC/cAMP/PKA信号通路的抑制作用而发挥疗效。且黄芩苷的药效较盐酸哌甲酯组升高更为明显，同时存在量效相关性，这充分说明黄芩苷在和治疗ADHD一线进口药品的比较中具有优势，值得我们深入研究。同时，本次研究也存在一定的不足之处，如黄芩苷治疗是否显著增加了SHR大鼠脑内DA的含量，增加效果是否也存在量效相关性，黄芩苷对DA系统释放、清除信号通路的影响如何，以及黄芩苷对SHR大鼠ADHD核心症状多动、冲动、注意力不集中等问题的改善情况等尚未进行研究，这些诸多问题仍需进一步的解决，本课题组将会针对此次研究发现的问题，在接下来的实验中联合运用行为学方法、质谱、液相及分子生物学方法等进行更深入的研究，以期为ADHD的研究提供参考，造福广大儿童。

Biography

周荣易, 男, 博士研究生

Funding Statement

江苏省教育厅研究生创新工程项目（KYZZ16_0410）；国家自然科学基金（81273801）