新复合杂合突变致婴儿型低磷酸酯酶症1例及其家系分析

Abstract

该文对1例婴儿型低磷酸酯酶症（HPP）患儿及其家系进行临床特点分析及碱性磷酸酯酶基因（ALPL）检测。先证者，男，5个月，多发骨骼畸形：胸骨凹陷、双侧桡骨弯曲畸形、双膝外翻畸形，伴喂养困难、体重下降、发育迟滞、反复肺炎并呼衰，血碱性磷酸酶显著降低。患儿父母、姐姐、叔父、姨母（其他家系成员未能配合）中除父母及姨母的碱性磷酸酶略低，姨母可见脊柱侧弯畸形，余均无临床表型及实验室异常。患者ALPL基因检测到来源于母亲的c.228delG突变及来源于父亲的c.407G > A复合杂合突变，其姨母携带c.228delG突变。c.407G > A突变为已报道的HPP致病突变，c.228delG为新的致病性突变。低磷酸酯酶症是由ALPL基因突变所致，ALPL基因检测是有效的诊断方法。该研究拓展了ALPL基因突变谱，为HPP的基因诊断提供了理论依据。

低磷酸酯酶症（hypophosphatasia, HPP, MIM146300, 241500, 241510）是一种以骨矿化不足、血清碱性磷酸酶（alkaline phosphatase, ALP）含量及活性降低、骨特异性碱性磷酸酶（bone-specific alkaline phosphatase, BALP）活性丧失为主要临床特征的遗传代谢性骨病^[1]。其遗传方式不确定，轻型的遗传方式可为常染色体隐性或显性，重型的多为常染色体隐性遗传。本病系罕见病，欧洲发病率约为1：300 000，美国报道的发病率为1：100 000^[2]。根据发病年龄和骨骼病变程度，HPP分为6型：先天致死型（围生期致死）、婴儿型、儿童型、成年型、齿型及假性低磷酸酯酶症^[1-3]。各型之间临床表现可有交叉。婴儿型多在1~6个月发病，多因体重不增、生长落后、颅骨软化、肋骨串珠等就诊，易被误诊为佝偻病^[4]。本研究通过对1例婴儿型HPP患儿及其家系的临床特点、碱性磷酸酯酶基因（alkaline phosphatase liver/bone/kidney, ALPL）测序结果进行分析，阐述该病的遗传学发病机制，以期提高临床医生对本病的认识，加强对本病的遗传咨询和产前诊断，降低此类患儿的出生率。

1. 资料与方法

1.1. 研究对象

患儿，男，5个月。因体重不增4月余，气促、反应差5 d入院。既往因肺炎住院4次，因呼吸衰竭多次抢救治疗。患儿为第二胎第二产, 足月顺产出生，出生体重3 100 g，出生时无窒息史。人工喂养，新生儿晚期即有喂养困难，体重不增并逐渐下降。至今不会抬头、翻身。入院查体：体重2 590 g，身长56 cm。体温36.0℃，心率147次/min，呼吸59次/min。皮肤干皱，皮下脂肪消失，前囟5×5 cm，骨缝宽，枕部触诊乒乓球感。双耳位偏低，下颌小，呼吸急促、见吸气三凹征，胸骨凹陷，可见肋骨串珠，双侧桡骨弯曲畸形，双膝外翻畸形。母孕期体健，否认毒物、放射线接触史。否认近亲婚配及家族遗传病史。辅助检查：血常规WBC 13.1×10⁹/L，余项正常；肝功能：谷丙转氨酶86 U/L（参考值9~50 U/L）、谷草转氨酶54 U/L（参考值15~45 U/L），余项正常；肌酸激酶（CK）正常；7次血钙波动在3.19~4.40 mmol/L（参考值2.08~2.60 mmol/L）；5次碱性磷酸酶波动在9~17 mmol/L（参考值40~750 mmol/L）；1, 25-二羟基维生素D₃（VitD₃）正常；甲状旁腺素3.5 pg/mL（参考值：6~80 pg/mL）；降钙素22.1 pg/mL（参考值：0~18 pg/mL）。血串联质谱分析未见异常。尿气相质谱示4-羟基苯乳酸偏高。胸部X线片：支气管肺炎。左腕关节正位片：骨矿化不良，左侧尺、桡骨远端干骺端先期钙化带骨小梁模糊，并见干骺端不规则骨质缺损，未见骨化中心（见图 1）。胸腰椎正位X线片：各椎体骨质疏松、椎间隙窄、肋骨串珠及骨质密度普遍降低。

1.

患儿5月龄左腕正位片

骨矿化不良，未见骨化中心；左侧尺、桡骨远端干骺端先期钙化带骨小梁模糊，并可见干骺端不规则骨质缺损（如箭头所示）。

1.2. 家系临床资料收集

收集先证者家系3代共计10人的病史资料，以及患儿及其父母、叔父、姨母、姐姐（其他家系成员未能配合）的VitD₃、PTH、降钙素、ALP、血钙等检查结果。

1.3. 目的基因扩增

获得医院医学伦理委员会批准及家属知情同意后采集先症者外周血5 mL及其父母、叔父、姨母、姐姐（其他家系成员未能配合）的外周血各2 mL。使用QiagenFlexiGene DNA Kit提取基因组DNA。http://genome.ucsc.edu/检索野生型ALPL基因序列（NM-000478）。使用引物设计软件Primer 5.0进行引物设计（见表 1），经NCBI Blast验证所有引物的特异性。反应体系（总体积25 μL）：DNA样品1 μL，上、下游引物各0.5 μL，2×Taq PCR superMix 12.5 μL，ddH₂0 10.5 μL。PCR扩增，预变性94℃ 5 min，变性94℃ 15 s，退火60℃ 30 s，72℃延伸30 s，35个循环后予末次延伸72℃ 5 min。采用2%琼脂糖凝胶电泳检验PCR产物，溴乙锭染色。

1.

ALPL基因编码区引物序列

1.4. Sanger测序验证及分析

PCR产物送北京康旭医学研究所行基因测序，对先证者及其家系成员所发现的ALPL基因突变位点进行Sanger测序验证。Swiss-model在线软件预测，并用Molpobity软件评价分析组织非特异性碱性磷酸酶（tissue-nonspecific alkaline phosphatase, TNAP/TNSALP）蛋白的三级结构模型。检索PubMed、HGMD、ESP6500及SESEP实验室ALPL基因数据库，并结合相关文献行家系分析。

2. 结果

2.1. 家系的临床表现及实验室检查结果

该家系（图 2）三代共计10人，男女各5人，除先证者及其姨母有骨骼畸形（查体及脊柱X线见脊柱侧弯畸形），余均无异常临床表型。家系中收集了VitD₃、PTH、降钙素、ALP、血钙等结果的成员中，患儿血钙增高、ALP明显降低，1, 25-二羟基维生素D₃、PTH均正常；其父母、姨母的碱性磷酸酶略低，1, 25-二羟基维生素D₃、血钙、PTH正常；患儿叔父、姐姐的血钙、ALP、1, 25-二羟基维生素D₃、PTH均正常。

2.

患儿家系图

患者父亲为c.407G > A突变携带者，母亲及姨母为c.228delG突变携带者。？示未行基因检测。

2.2. 患儿及家系基因测序结果

该家系中患儿及其父母、叔父、姨母、姐姐（其他家系成员未能配合）进行了ALPL基因测序。患儿ALPL基因存在复合杂合突变，分别位于chr1：21887636及chr1：21889712，引起c.228delG和c.407G > A两处突变；患儿父亲携带c.407G > A突变；患儿母亲及姨母携带c.228delG突变；患儿姐姐、叔父的两突变位点均正常。见图 3。

3.

患儿家系ALPL基因测序结果

患儿ALPL基因存在c.228delG（A）和c.407G > A (B) 的复合突变；患儿父亲为c.407G > A突变携带者；母亲及姨母为c.228delG突变携带者；患儿姐姐、叔父的两突变位点均正常。突变位点如箭头所示。

2.3. TNAP蛋白三级结构预测

用Swiss-model在线软件分别构建野生型及突变型TNAP蛋白三级结构模型，预测c.228delG及c.407G > A突变对TNAP蛋白结构的影响，并用Molpobity软件评价分析TNAP蛋白三级结构模型。结果显示：两突变致使TNAP蛋白A链结构发生改变，c.228delG影响一小段肽段，c.407G > A导致一个氨基酸位点改变，见图 4。

4.

TNAP蛋白质结构飘带图

红色圈内为突变影响区域。左图右下角的灰色小图为受影响区域放大图，其涂色段为c.228delG突变影响的肽段；右图左上角小图为突变影响位点的放大图，其紫色圈内为c.407G > A突变的氨基酸突变位点。

3. 讨论

HPP在1948年由Rathbun首次报道，又称Rathbun综合症^[5]，系因ALPL基因（又称TNS-ALP基因，编号：249；MIM-171760）突变所致。ALPL基因定位于染色体1p36-34，编码TNAP。TNAP在软骨细胞、成骨细胞、成牙本质细胞以及这些细胞分泌的基质小泡中都有表达，TNAP水解细胞外矿化抑制物无机焦磷酸盐（pyrophosphate, PPi），从而启动并促进骨组织矿化^[1]。TNAP蛋白有5个重要的结构域，包括激活点、激活谷、钙结合位点、同型二聚体区及冠区，当基因突变使这些重要的结构区域发生改变时，组织非特异性碱性磷酸酶活性受到严重影响^[6]，进而影响骨骼矿化而致病。

HPP分为先天致死型（围生期致死型）、婴儿型、儿童型、成年型、齿型、假性低磷酸酯酶症6型。先天致死型最严重，多因死胎或出生后呼吸衰竭死亡^[7]。婴儿型多在1~6个月发病，1岁左右死亡，常表现为体重不增、生长落后及类佝偻病，继发高钙血症者可致肾结石、肾损害，以及食欲差、呕吐、便秘、多饮、多尿、发热等^{[4, 8]}。儿童型在2岁后发病，多因牙列早脱就诊，ALP显著减低，并且与疾病严重程度相关。成年型多中年以后发病，少数患者有关节、肌腱、椎间韧带钙化。牙型仅有牙冠矿化受阻表现如牙齿生长异常及恒牙早脱^[2]。假性低磷酸酯酶症极罕见，临床表现及X线特点与婴儿型、儿童型、成年型相同，但ALP正常。国内报道的婴儿型HPP，除麻宏伟等报道的1例出生胎龄28周早产儿7月龄发病外，均于1~6月龄发病，均有反复的呼吸道感染、呼吸衰竭、喂养困难、营养不良等表现^[9-14]。本研究先证者5月龄，新生儿晚期即出现喂养困难、体重不增并逐渐下降，具有骨矿化不全、骨骼畸形以及ALP水平降低、血钙增高等表现，符合婴儿型HPP的临床特点。

HPP临床表型的异质性及影像学表现的多样性不影响X线作为HPP临床诊断的重要依据^[15]。几乎所有HPP患者的X线均可见骨矿化不足、骨质疏松、类佝偻病表现。本例患儿左腕X有骨矿化不良，骨化中心消失，干骺端先期钙化带骨小梁模糊等表现；脊柱X线显示各椎体骨质疏松、肋骨串珠、骨质密度普遍降低，符合HPP的X线特点。

ALPL基因突变是诊断HPP的金标准。目前国内已报道的婴儿型HPP患儿的突变位点包括ALPL基因第1、5、7、9、12外显子^{[10, 12-13]}。国外HPP基因检测开展较早，报道的ALPL基因突变位点达332种，以点突变为主，大片段缺失仅9例。本研究使用二代基因测序筛查出可疑致病突变点，并用Sanger测序法验证，检测到先证者ALPL基因c.228delG和c.407G > A复合杂合突变。

c.228delG位于第4外显子，引起编码区第228号核苷酸G缺失，导致从第76号氨基酸谷氨酰胺（Gln）开始的氨基酸合成改变，并在改变后的第46个氨基酸即第112号氨基酸处终止（p.Gln76HisfsTer46），故为移码突变；该突变来源于其母，其姨母亦有此突变。c.407G > A位于第5外显子，即编码区第407号核苷酸由G变为A，导致第136号氨基酸由精氨酸（Arg）转变为组氨酸（His）（p.Arg136His）；该突变来源于其父亲。患儿姐姐、叔父未见上述两种突变，且无临床症状。检索PubMed、HGMD、ESP6500及SESEP实验室的ALPL基因数据库，发现c.407G > A的致病性已有文献报道，与HPP相关^[16]；SIFT、MutationTaster及PolyPhen-2软件预测也提示c.407G > A导致p.Arg136His，136号氨基酸精氨酸参与蛋白质残基侧链间的相互作用。c.228delG的致病性尚未见报道。经检索1000Genomes、dbSNP数据库，该变异也不属于多态性变化，在人群中发生的频率极低。SIFT、MutationTaster及PolyPhen-2蛋白质功能预测软件提示，c.228delG导致从第76号氨基酸谷氨酰胺（Gln）开始的氨基酸合成发生改变，并在改变后的第46个氨基酸即第112号氨基酸处终止；由于110号氨基酸所处位置是酶激活位点及金属离子结合位点^[17]，推测突变可能影响酶与底物的结合以及蛋白功能。本研究先证者遗传了来自父亲的c.407G > A及来自母亲的c.228delG复合杂合突变，出现典型的临床症状；其父、母亲及姨母分别为c.407G > A、c.228delG突变携带者，无临床症状，故两突变在本家系中的遗传方式可能为常染色体隐性遗传，先证者同胞中基因型正常的概率为25%，如果该家系中患儿父母再次孕育，应当寻求适当的遗传学帮助，并进行产前诊断。

部分轻症HPP可自愈，病情较重者需采取多学科综合管理。血钙增高程度较重者可使用鲑降钙素治疗，并注意骨骼脱矿化所致的骨缺损及骨折的矫形管理，以及营养不良者的饮食管理和抗炎止痛药的应用。美国食品药品管理局于2013年批准了靶标酶置换药Asfotase Alfa作为先天致死型、婴儿型、儿童型HPP的治疗用药。Scott等^[18]对11例3岁以下低磷酸酯酶症患儿予以24周的Asfotase Alfa治疗后，患者骨折愈合、畸形减轻、骨质重塑；并明显改善了因严重呼吸道感染所致呼吸衰竭患儿的呼吸功能；患儿的大运动、精细运动，以及认知发育、肌力均得到改善，并观察到追赶性生长。

综上，本研究通过1例婴儿型低磷酸酯酶症患儿的家系分析，总结了HPP的临床特点，发现了ALPL基因的一个新致病突变，对于提高临床医生对HPP的认识和诊断能力，以及加强对本病的遗传咨询和产前诊断、降低HPP患儿的出生率有一定的意义。

Biography

李登峰, 男, 硕士研究生, 医师

Funding Statement

广西医科大学第一附属医院科研启动基金资助项目（No.2010001）