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. 2017 May 25;19(5):534–538. [Article in Chinese] doi: 10.7499/j.issn.1008-8830.2017.05.011

2例X-连锁低血磷性佝偻病患者PHEX基因新发突变的研究

Novel PHEX gene mutations in patients with X-linked hypophosphatemic rickets: an analysis of 2 cases

冉 情 1, 熊 丰 1,*, 朱 岷 1, 邓 蕾丽 1, 雷 培芸 2, 罗 雁红 1, 曾 燕 1, 朱 高慧 1, 宋 萃 1
PMCID: PMC7389139  PMID: 28506344

Abstract

目的

研究2例X-连锁低血磷性佝偻病（XLH）患儿及家系磷酸盐调节基因（PHEX）的突变类型，以明确其遗传学病因。

方法

回顾性分析2例XLH患者临床资料，应用高通量测序技术从基因组水平对先证者的XLH致病基因PHEX进行检测，并应用PCR-Sanger测序法对突变基因的家系分布进行验证。

结果

2例患儿均检测到PHEX基因新发突变，1例为移码突变c.931dupC，导致翻译提前终止，产生截短蛋白p.Gln311Profs*13；另1例为剪接位点突变IVS14+1G > A，导致外显子15跳跃，产生不完整的氨基酸链。2例患儿父母的基因表型均正常。

结论

c.931dupC和IVS14+1G > A是PHEX基因的两个新突变，可能是XLH新的致病性突变。

Keywords: 低血磷性佝偻病, 磷酸盐调节基因, 突变分析, 儿童

X-连锁低血磷性佝偻病（X-Linked hypophos-phatemic rickets, HYP或XLH, OMIM #307800）是低血磷性佝偻病中最常见的一种，发病率约为1/20 000[1-2]。XLH症状多于1岁以后症状明显，多为X-连锁显性遗传，发病机制为磷酸盐调节基因（phosphate regulating gene with homologies to endopeptidases on the X-chromosome, PHEX）突变导致血清成纤维生长因子23（FGF23）水平升高，影响肾小管对磷的重吸收，导致尿磷排泄增多、血磷水平下降[3-4]。XLH早期表现为骨骼和牙不同程度的损害，如方颅、鸡胸、漏斗胸、肋骨串珠、肋外翻、手足镯，出牙延迟、易脱落、牙痛，直立行走后出现下肢骨软化症状：“X”或“O”型腿，骨骼疼痛、生长迟缓等[5-6]；后期可出现牙脓肿、关节活动障碍[6-7]。补充磷制剂可改善其临床症状。

国内外已报道444例PHEX基因突变所致的XLH患者，多发生于外显子（约占79%），包括缺失、插入、错义及无义突变等；部分发生于内含子（约占19%），包括剪接位点突变；极少数发生于非翻译区（untranslated regions, UTR）[8-9]。XLH的基因变异具有明显的异质性，多种突变形式可引起相似的临床表现。本研究采用PCR-Sanger测序方法，分析2例低血磷性佝偻病患儿的PHEX基因，发现2种未见报道的PHEX基因新突变。

1. 资料与方法

1.1. 研究对象

先证者1，男，3岁4个月，发现“O型腿”2年。不伴骨痛。第一胎第一产、足月顺产出生，出生时身长、体重不详，出生时无窒息。母乳喂养，10月龄添加辅食，无偏食挑食。7月龄能独坐、10月龄独站、1岁2个月能独立行走。既往体健。患儿父母健康，否认近亲结婚，家族中无类似患者。体格检查：身高82 cm（-4.34 SD），体重11 kg，前额突出，无方颅，无鸡胸，无肋骨串珠，无郝氏沟，无手足镯，心肺腹部查体未见异常，“O型腿”、膝间距9 cm。实验室检查：血钙正常，血磷1.04 mmol/L（参考值：1.3~2.1 mmol/L），ALP 792.8 U/L（参考值：95~405 U/L），25(OH) D3正常，PTH正常。血气分析无异常。下肢骨片（见图 1）：双膝关节骨骺端稍膨大，临时钙化带模糊。肾脏B超无异常。

1.

先证者1的髋关节、下肢X片

股骨远端及近端钙化带模糊，如箭头所示。

1

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先证者2，女，7岁4个月，发现“X型腿”伴双下肢间断性疼痛5年。第一胎第一产、足月顺产出生，出生身长、体重不详，出生时无产伤、无窒息。喂养史、生长发育史无特殊。既往体健。患儿父母体健，否认近亲结婚，家族中无类似患者。体格检查：身高111.2 cm（-2.61 SD），体重22.5 kg，无方颅，无鸡胸，无郝氏沟，无肋串珠，无手足镯，心肺腹部查体未见明显异常，“X型腿”、踝间距12 cm。实验室检查：血钙正常，血磷0.5 mmol/L（参考值：1.3~2.1 mmol/L），ALP 428 U/L（参考值：95~405 U/L），PTH 110 pg/mL（参考值：10~69 pg/mL）。肾脏B超：双肾皮质回声稍增强，双侧肾椎体见少许钙质成分沉着。

1.2. 高通量捕获测序、突变验证及家系分析

通过重庆医科大学附属儿童医院伦理审查及患儿家属知情同意后，采集患儿及其父母空腹EDTA抗凝静脉血各2 mL，提取基因组DNA。DNA浓度 > 10 ng/μL，体积 > 100 μL；纯度应达到A260/280 > 1.8，A260/230 > 1.2。

取先证者基因组，对PHEX基因的外显子区及两侧的剪接位点序列进行高通量测序，并利用PCR-Sanger测序对先证者及家系进行突变验证和分析（中国人民解放军空军医学研究所附属医院病理检验中心完成）。引物设计根据GeneBank人类PHEX基因序列（NG_007563.2），见表 1。PCR扩增，取PCR样品用ABI遗传分析仪进行测序。阳性突变者用另一份备用样品进行复测。

1.

PHEX基因引物序列

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2. 结果

2.1. 基因测序结果

经高通量捕获测序，发现先证者1在PHEX基因第14号内含子剪切位点发生单碱基置换：IVS14+1G > A；运用PCR-Sanger测序进行突变验证及家系分析，证实患儿父母该基因位点正常。见图 2。先证者2的PHEX基因检测到1个杂合突变：位于8号外显子的移码突变c.931dupC；运用PCR-Sanger测序进行突变验证及家系分析，发现患儿父母该基因位点正常。见图 3。

2.

先证者1及家系的PHEX基因测序图

先证者1在第14号内含子发生单碱基置换：IVS14+1G > A，突变位点如箭头所示；其父母该位点正常。

2

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3.

先证者2及家系的PHEX基因测序

先证者2在第8号外显子发生碱基插入突变：c.931dupC，突变位点如箭头所示；其父母该位点正常。

3

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经查询Locus Database数据库，PHEX基因的c.931dupC和IVS14+1G > A两个突变均未见报道。查阅PUBMED（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/）和CNKI（http://www.cnki.net/）及万方（http://www.wanfangdata.com.cn/）文献数据库，均无该基因突变的文献报道。因此，本文检测到的2种PHEX基因突变为新突变。经MUTATION TASTER（www.mutationtaster.org/）生物信息学分析，2例突变均为致病性突变，但未行相关基因功能学研究。

3. 讨论

至2016年11月，PHEX database数据库已报道444例XLH患者，共计338种PHEX基因突变，其中由中国人报道的突变共计13种。PHEX基因突变中移码突变约占27%，错义突变占21%，剪接位点突变占19%。但中国人群中最多见的PHEX基因突变类型是无义突变（约占30%），其次为错义突变（约占22%），剪接位点突变约占21%。本研究2例XLH患儿检测到PHEX基因突变，分别为移码突变c.931dupC和剪接位点突变IVS14+1G > A，均为国际上首次报道的新突变。在我国已报道的XLH病例中[9-14, 16-17]，PHEX基因突变以E18、E22外显子突变更为多见；而在PHEX数据库中，以E09、E22外显子突变较为常见。这提示PHEX基因突变呈散在分布，可能与种族、性别、地区等因素相关。

本研究先证者1的IVS14+1G > A突变位于14号内含子，MUTATION TASTER（www.mutationtaster.org/）生物信息学分析提示突变“GA-A-GA”为经典的剪切位点突变方式，可影响外显子的剪切，导致外显子跳跃，产生不完整的氨基酸链，合成异常蛋白。PHEX数据库中共报道了4种类型的内含子14（I14）基因突变，其中3例为碱基缺失（IVS14，c.1584+3delGAGT；IVS14+1，c.1586+1delGA；IVS14+3，c.1586+3delGAGT），另1例为同区域剪接位点碱基突变（IVS14-1，c.1587-1G > C）导致剪接位点异常[8, 18-20]。2012年Beck-Nielsen等[8]报道1例31岁的女性低血磷性佝偻病患者在PHEX基因内含子14位置上发生突变：IVS14-1，c.1587-1G > C，引起内含子保留和外显子跳跃，患者身高157 cm（-1.8 SD），表现为轻微骨骼畸形，严重牙病变，无骨折史；血磷低，1, 25(OH)2D3水平正常，PTH轻度升高，骨密度正常。本研究先证者1发生的IVS14+1G > A突变，影响了外显子剪切，可能导致外显子15的跳跃而产生不完整的氨基酸链。本研究与Beck-Nielsen等报道的患者相比，血生化表现一致，但尚无牙病变，下肢畸形较严重，身高较正常同龄儿减低。这可能与种族、年龄或性别不同有关，也可能PHEX基因突变即使发生在同一内含子不同位置，疾病的表现在也可不一致。2013年，Yue等[14]发现3例患儿分别在内含子I10（c.1174-1G > A）、I15（c.1646-2A > T）、I17（c.1768+2T > G）发生突变，这3例患儿均为男性，起病年龄0.75~5岁，2例有家族史、1例为散发，均有“O型腿”表现，无牙龈病变，与本研究的患儿表现一致。这表明基因突变的类型与表型不一定有明显的相关性。

本研究先证者2检测到PHEX基因位于8号外显子的c.931dupC移码突变：p.Gln311Profs*13，MUTATION TASTER（www.mutationtaster.org/）生物信息学分析提示，它可导致311位的氨基酸由Gln（谷氨酰胺）转变为Pro（脯氨酸），在323位出现终止密码“UGA”，编码的氨基酸序列转变为P PVRLA GLHQE GH*，导致编码氨基酸提前终止、PHEX蛋白结构及功能异常，为致病性突变。该患儿骨骼畸形明显，提示移码突变产生的截短蛋白可能导致严重的表型。目前PHEX database数据库已报道6例外显子8突变（C.871C > T，c.931C > T，c.888+2G > T，c.904A > G，c.914T > C，c.897_898del），其中5例点突变（2例错义突变、3例无义突变），1例为缺失突变[1, 18, 20-23]。目前PHEX数据库中尚无8号外显子插入突变的报道。

本研究2例XLH患儿检测到2个国际上首次报道的PHEX基因新突变，丰富了XLH的致病基因谱，有助于深入认识PHEX基因的异质性。

Biography

冉情, 女, 硕士研究生

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