Abstract
目的
探讨人巨细胞病毒（HCMV）感染患儿HLA-DR、CD4+CD25+调节性T细胞（CD4+CD25+Treg）以及IL-17、IL-27的表达水平与肝功能损害的相关性。
方法
以21例HCMV感染肝功能损害患儿和21例HCMV感染非肝功能损害患儿为研究对象。流式细胞术检测两组外周血CD4+CD25+Treg、HLA-DR细胞的表达；ELISA检测血浆IL-17及IL-27表达。
结果
与非肝损组比较，肝损组患儿CD4+CD25+Treg比率较低，IL-17、IL-27表达水平较高，差异均有统计学意义（P < 0.05）。IL-17及IL-27水平与CD4+CD25+Treg细胞比率呈负相关（P < 0.01）。
结论
CD4+CD25+Treg细胞介导的免疫耐受失衡及IL-17、IL-27等炎症因子过度激活可能参与HCMV感染肝功能损害发生。
Keywords: 人巨细胞病毒, 肝功能损害, CD4+CD25+调节性T细胞, HLA-DR, 炎症因子, 儿童
Abstract
Objective
To study the relationship between the expression of peripheral blood HLA-DR, CD4+ CD25+ regulatory T cells, IL-17 and IL-27 with liver damage in children with human cytomegalovirus (HCMV) infection.
Methods
Twenty-one HCMV children with liver damage and twenty-one HCMV children without liver damage were enrolled in this study. The expression of peripheral blood HLA-DR and CD4+ CD25+ regulatory T cells was detected by flow cytometry. Plasma levels of IL-17 and IL-27 were measured using ELISA.
Results
The plasma levels of IL-17 and IL-27 in children with liver damage were significantly higher than in those without liver damage, while the expression of peripheral blood CD4+ CD25+ regulatory T cells was lower than in those without liver damage (P < 0.05). Plasma IL-17 and IL-27 levels were negatively correlated with the expression of peripheral blood CD4+ CD25+ regulatory T cells (P < 0.01).
Conclusions
Immune imbalance mediated by CD4+ CD25+ regulatory T cells and over-expression of IL-17 and IL-27 may be involved in the pathogenesis of liver damage in children with HCMV infection.
Keywords: Human cytomegalovirus, Liver damage, CD4+CD25+ regulatory T cell, HLA-DR, Inflammatory factor, Child
人巨细胞病毒（human cytomegalovirus, HCMV）感染多发生在婴儿期，可引起多脏器损伤，如进行性肝损害、胆道梗阻或胆道闭锁、听力障碍等，以肝损害较多见[1]。体液免疫、细胞免疫及炎症因子与HCMV肝炎的发生发展密切相关[2-3]。CD4+CD25+调节性T淋巴细胞（regulatory T cell, Treg）是介导免疫耐受的重要细胞群，在病毒性肝炎、自身免疫性肝炎等肝脏疾病的发病机制中起着重要作用。IL-17、IL-27在固有免疫和适应性免疫中起调节作用，还可抑制CD4+CD25+Treg表达，共同参与肝脏炎症反应[4-5]。HLA-DR是单个核细胞活化的重要标志，可作为判断免疫抑制的重要指标，在自身免疫性肝炎、重症感染的发生机制中均有重要作用[6]。但这些细胞及细胞因子是否与HCMV感染患儿肝损害发生相关尚不清楚。因此，本研究通过比较是否合并肝损害的HCMV感染患儿CD4+CD25+Treg、HLA-DR及IL-17、IL-27的表达差异，探索HCMV感染肝损害的可能发病机制，发现巨细胞病毒肝炎治疗的潜在靶点。
1. 资料与方法
1.1. 研究对象
以2016年1月至2017年12月徐州医科大学附属儿科医院确诊的1岁以内（不包括新生儿）的巨细胞病毒感染、且未进行规范抗病毒治疗的患儿为研究对象。根据肝功能损害的诊断标准[7]，将HCMV感染患儿分为肝功能损害组及非肝功能损害组，每组21例。两组在年龄、性别构成以及巨细胞病毒DNA含量的差异无统计学意义（P > 0.05），见表 1。HCMV感染肝损组男13例、女8例，年龄为2~10（5.9±2.4）个月，表现为单纯肝功能损害的12例，合并肺炎7例，合并上呼吸道感染2例；而非肝损组男14例、女7例，年龄（5.3±2.7）个月，表现为无症状感染的10例，合并肺炎的8例，合并上呼吸道感染的3例。巨细胞病毒感染诊断依据《儿童巨细胞病毒性疾病诊断和防治的建议》[8]，尿液聚合酶链式反应巨细胞病毒DNA阳性，均无胆道畸形、代谢性肝病、药物中毒性肝炎等；肝炎病毒、EB病毒、呼吸道病毒等常见病毒均阴性。肝损害诊断标准[7]：血清丙氨酸转氨酶或结合胆红素升高至正常上限2倍以上；或血清天冬氡酸转氨酶、碱性磷酸酶和总胆红素同时升高，且其中至少1项升高至正常上限2倍以上。
1.
HCMV感染患儿肝损组与非肝损组的一般资料比较
| 分组 | 例数 | 年龄(x±s, 月) | 性别(男/女) | 尿PCR-CMV-DNA定量[中位数(范围), IU/mL] |
| 肝损组 | 21 | 5.9±2.4 | 13/8 | 1.08×105(1.76×103~5.09×106) |
| 非肝损组 | 21 | 5.3±2.7 | 14/7 | 1.38×105(1.38×103~7.88×108) |
| Z(χ2)[t]值 | [0.72] | （0.10） | -1.75 | |
| P值 | > 0.05 | > 0.05 | > 0.05 |
本研究获医院临床伦理委员会批准及家长知情同意。
1.2. 主要试剂及仪器
PE-CD4抗体、FITC-CD25抗体、PerCP/Cy5.5-HLA-DR抗体购自美国Biolegend公司；抗人IL-17、IL-27 ELISA试剂盒购自徐州康美生物科技有限公司；FC500型流式细胞仪（法国Beckman Coulter公司）由我院中心实验室提供。
1.3. 流式细胞仪检测CD4+CD25+Treg、HLA-DR细胞含量
清晨空腹采集患儿外周血2 mL，EDTA抗凝，加入2 mL淋巴细胞分离液，密度梯度离心提取单个核细胞置于离心管，加入2 mL磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤2次，弃上清液，分别加入相应的荧光标记抗体：PE-CD4抗体、FITC-CD25抗体或PerCP/Cy5.5-HLA-DR抗体，室温下震荡混匀，避光孵育约20 min；加入PBS 2 mL，1 500 r/min离心5 min，弃上清，再次加入PBS液，重复以上步骤后离心，弃上清，加PBS重悬细胞，取200 μL细胞进行流式细胞学检测，以CellQuest软件计算CD4+CD25+Treg、HLA-DR细胞的表达。
1.4. ELISA方法检测IL-17、IL-27水平
所有患儿均清晨空腹采集外周血2 mL，EDTA抗凝，加入2 mL淋巴细胞分离液，1 500 r/min离心15 min，吸取血浆分装于EP管，-80℃冰箱冻存。应用IL-17、IL-27 ELISA试剂盒，采用酶联免疫吸附法检测IL-17、IL-27水平，操作按试剂盒说明书进行，并通过标准曲线计算IL-17、IL-27浓度。
1.5. 统计学分析
采用SPSS 16.0软件进行数据处理。正态分布的计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，两组比较采用独立样本t检验；非正态分布计量资料采用中位数范围表示，两组比较采用Mann-Whitney U非参数检验。采用Pearson相关分析法对各项参数的相关性进行分析。P < 0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1. 两组HLA-DR、CD4+CD25+Treg、IL-17及IL-27的表达水平比较
与HCMV感染非肝损组比较，肝损组Treg表达减低，IL-17、IL-27表达增高（P < 0.05），两组间HLA-DR水平的差异无统计学意义（P > 0.05）。见表 2、图 1~2。
2.
HCMV感染患儿肝损组与非肝损组HLA-DR、CD4+CD25+Treg、IL-17及IL-27水平比较 （x±s）
| 分组 | n | HLA-DR (%) | CD4+CD25+Treg (%) | IL-17 (pg/mL) | IL-27 (pg/mL) |
| 非肝损组 | 21 | 32±11 | 3.9±1.6 | 19±5 | 38±16 |
| 肝损组 | 21 | 32±10 | 2.7±1.4 | 23±5 | 50±12 |
| t值 | 0.26 | 2.58 | -2.55 | -2.73 | |
| P值 | > 0.05 | < 0.05 | < 0.05 | < 0.01 |
1.
HCMV感染患儿外周血CD4+CD25+Treg细胞的表达
HCMV感染肝损组的Treg细胞表达（右上象限区域代表Treg细胞表达）低于非肝损组。
2.
HCMV感染肝损与非肝损患儿外周血HLA-DR的表达
第二波形区域即为HLA-DR细胞阳性表达区域。
2.2. HCMV感染肝损患儿IL-17、IL-27水平与CD4+CD25+Treg表达的相关性分析
Pearson相关分析显示，HCMV感染肝损患儿外周血IL-17、IL-27水平与CD4+CD25+Treg表达呈负相关，P < 0.05。见图 3。
3.
HCMV感染肝损患儿外周血IL-17、IL-27水平与Treg表达的相关性分析
3. 讨论
HCMV感染可引起多脏器损伤，尤其以肝损害多见。目前HCMV感染肝损发生机制仍未完全明确，研究表明HCMV并不直接损伤肝细胞，感染后的免疫炎症反应可能是HCMV感染肝细胞损伤的重要因素[3]。
CD4+CD25+Treg细胞具有突出的免疫负调控作用，与感染性疾病关系密切，是维持机体免疫耐受的重要调控者[9]。有研究发现：CMV感染急性期Treg细胞比率下降，而恢复期Treg细胞比例增多[10]。郭声等[11]发现，乙肝患者Treg细胞表达随着肝损加重而降低，表明Treg细胞能抑制炎症反应、减轻肝细胞损伤。郭荻等[12]在自身免疫性肝炎患者中证明，Treg细胞表达下降与肝损进展密切相关。本研究中巨细胞病毒感染肝损组的CD4+CD25+Treg细胞表达较非肝损组明显降低，与文献相符。
IL-17由Thl7细胞产生，可刺激巨噬细胞、成纤维细胞、内皮细胞释放多种炎性细胞因子，从而促进炎症发生；IL-17的水平可反映Th17细胞的功能状态[13]。Zhang等[14]发现慢性乙肝患者血清和肝组织的IL-17与HBV-DNA、ALT水平呈正相关，提示IL-17参与了肝脏炎症反应，诱导炎症环境下肝脏的病理损伤。另一项研究表明，HCMV肝炎肝组织IL-17的表达强度与肝脏纤维化程度密切相关[15]。而Th17细胞与Treg细胞相互抑制、相互拮抗，抑制免疫耐受，导致免疫失衡[16-17]。本研究HCMV感染肝损组患儿的血浆IL-17明显高于非肝损组，并且IL-17与Treg细胞表达呈负相关，与文献相符，表明Th17细胞介导肝脏免疫反应增强，Th17细胞与Treg细胞相互拮抗促进HCMV感染患儿肝损害发生。
IL-27是IL-6/IL-12细胞因子家族成员之一，是抗原提呈细胞分泌的促炎因子。IL-27可以增强Th1型免疫反应，抑制Th2型免疫反应，诱导B细胞分化，促进辅助性T细胞分化，增强杀伤性T淋巴细胞活性，增强抗病毒作用[18-19]。IL-27还能抑制Treg细胞分化，减少Treg细胞数量，抑制其免疫调节作用[20]。有研究发现，慢性乙肝患者IL-27增高程度与肝损坏的严重程度正相关，IL-27促进乙肝病毒清除的同时可以增强肝脏的炎症反应[21]。本研究HCMV感染肝损患儿血浆IL-27水平高于非肝损组，而且表达水平与Treg细胞表达呈负相关，提示IL-27抑制Treg细胞分化，导致免疫耐受失衡、肝脏炎症反应增强，促使肝损发生。
HLA-DR作为单个核细胞活化的重要标志，与抗原提呈能力直接相关。HLA-DR的表达是判断免疫抑制的重要指标。有研究发现，自身免疫性肝病患者肝组织的HLA-DR表达减少，且其减低程度与转氨酶增高密切相关[22-23]。但本研究肝损组HLA-DR表达水平与非肝损组的差异无统计学意义，因此对于HLA-DR与HCMV感染肝损的关系还有待进一步研究。
综上所述，CD4+CD25+Treg细胞介导的免疫耐受失衡及IL-17、IL-27等炎症因子过度激活可能参与HCMV感染肝功能损害的发生。
Biography
朱莉莉, 女, 硕士研究生
Funding Statement
江苏省六大人才高峰资助项目[2011-WS-075]
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