抽动障碍儿童Th淋巴细胞及其亚群的变化

Abstract

目的

探讨抽动障碍（TD）儿童T辅助（Th）淋巴细胞及其亚群表达变化的临床意义。

方法

采用流式细胞技术检测TD组和对照组（健康儿童）外周血中Th淋巴细胞及其亚群的表达水平。

结果

与对照组比较，TD组Th淋巴细胞的百分比明显降低，差异有统计学意义（P < 0.001）；Th淋巴细胞的异常率为68.7%，比对照组（18.8%）增高（P < 0.001）；而且Th淋巴细胞百分比和耶鲁综合抽动严重程度评分呈负相关（r=-0.3945，P < 0.001）。在Th淋巴细胞亚群中，TD组Th1淋巴细胞百分比明显高于对照组，而Th2淋巴细胞百分比明显低于对照组，差异均有统计学意义（P < 0.001）。

结论

Th淋巴细胞及其亚群的平衡失调导致的细胞免疫功能异常可能与儿童TD的发生相关，且Th淋巴细胞水平可作为评估TD严重程度的指标。

抽动障碍（tic disorders, TD）是以运动抽动和/或发声抽动为特征的神经精神障碍，可累及全身不同部位的肌肉，具有不自主、快速、频繁发作等特点。TD临床症状多变，容易反复，且治疗效果欠佳，对患儿的学习、生活和社交能力造成严重不良影响，也给家长带来沉重的心理负担。目前TD的病因和发病机制尚不明确，一般认为是遗传与环境因素共同作用，导致中枢神经系统递质失衡的结果^[1]。近年来TD的患病率呈明显上升的趋势，可能和外界过敏原刺激以及病原微生物感染后引起体内免疫功能的异常息息相关。研究表明多种病毒的感染可能与TD的发病有一定关系，这些病原体感染机体后，会使T淋巴细胞亚群中的T辅助（Th）和T抑制（Ts）淋巴细胞发生平衡失调，导致细胞免疫功能紊乱^[2]。本研究拟进一步探讨Th淋巴细胞及其亚群的表达变化在TD中的临床意义，分析其与反映TD症状分级的耶鲁综合抽动严重程度评分（Yale Global Tic Severity Scale, YGTSS）^[3]之间的相关性，旨在为TD病情的评估提供客观的依据，并发展可能有价值的干预手段。

1. 资料与方法

1.1. 研究对象

选择2016年1月至2017年8月在我科治疗的TD患儿和同时期在我院儿童保健门诊体检的健康儿童作为研究对象。纳入TD患儿150例，其中男127例（84.7%），女23例（15.3%）；年龄7.5±2.2岁。TD患儿入组条件：（1）符合美国精神疾病诊断统计手册第4版中TD的诊断标准^[4]；（2）为初诊TD患儿，未使用治疗药物。对患儿最近1周出现的抽动症状，按照YGTSS评分法进行评分^[3]：轻度 < 25分，中度25~50分，重度 > 50分。正常对照组共纳入健康体检儿童80例，其中男67例（83.8%），女13例（16.2%）；年龄7.6±1.9岁。对照组入组条件：（1）排除TD及其他神经系统疾病；（2）无感染性、慢性以及恶性疾病等；（3）近期未使用过任何药物。两组儿童年龄、性别比较差异均无统计学意义（P > 0.05）。本研究通过我院伦理委员会审核批准，并获得监护人知情同意。

1.2. 试剂与仪器

采用美国BD公司的淋巴细胞亚群检测试剂。荧光标记的单克隆抗体：CD3-FITC/CD8-PE/CD45-PerCP/CD4-APC、CD3-PerCP/CD8-FITC/IFN-γ-APC/IL-4-PE；相应的同型对照；配套的溶血剂（FACS lysing solution）、穿孔素（FACS permeablizing solution）；刺激剂：佛波醇酯类（PMA）和离子霉素；蛋白转运抑制剂（BFA）；RPMI1640培养液；乙二胺四乙酸（EDTA）、二甲基亚砜（DMSO）和磷酸盐缓冲溶液（PBS）。检测仪器为美国BD公司的FACSCalibur流式细胞仪。

1.3. 标本采集

清晨空腹抽取TD患儿和健康对照组4 mL静脉血，其中2 mL用肝素钠抗凝进行Th淋巴细胞及其亚群检测；另外2 mL用于总IgE和抗链球菌溶血素“O”（ASO）检测，并保存少量血清于冻存管中，放置在-80℃冰箱备检γ-干扰素（IFN-γ）和白细胞介素-4（IL-4）的含量。

1.4. T淋巴细胞亚群检测

用流式细胞仪专用试管分别加入20 μL的MultiTEST荧光单抗和50 μL的抗凝全血，混匀后室温避光放置15 min，加入450 μL的溶血素，混匀放置15 min，上机检测。应用MultiSet软件分析获得T淋巴细胞亚群CD3⁺、CD3⁺CD4⁺、CD3⁺CD8⁺的百分率和CD4⁺/CD8⁺比值，其中CD3⁺细胞代表总T淋巴细胞，CD3⁺CD4⁺细胞代表Th淋巴细胞，CD3⁺CD8⁺细胞代表Ts淋巴细胞。

1.5. Th淋巴细胞亚群的检测

从两组标本中随机各抽取40例进行Th淋巴细胞亚群的检测。取200 μL肝素钠抗凝全血加入等体积的RPMI1640，然后加入20 μL的50 ng/mL的PMA和8 μL的1 μg/mL的离子霉素以及8 μL的BFA，37℃水浴箱中孵育5 h后，收集细胞。未刺激样本同上处理，但不加PMA和离子霉素刺激。标记4支上样管，分别为刺激、未刺激样本管和刺激、未刺激对照管，加入CD3-PerCP和CD8-FITC各20 μL，混匀，室温避光孵育20 min；然后加入1 mL溶血剂10 min，洗涤，2 000 rpm离心5 min，弃上清；加入500 μL穿孔素10 min，洗涤，2 000 rpm离心5 min，弃上清。样本管加入5 μL的IFN-γ-APC和20 μL的IL-4-PE；对照管加入相应的同型抗体，室温避光孵育30 min，洗涤，2 000 rpm离心5 min，弃上清；加入300 μL的PBS重悬细胞，上机检测。以前向角（FSC）和侧向角（SSC）散射光散点图设门区分淋巴细胞，以CD3和CD8散点图设门区分Th细胞（CD3⁺CD8^-），最终以IFN-γ和IL-4的散点图表示Th1淋巴细胞和Th2淋巴细胞。应用CellQUEST Pro软件分析结果。

1.6. 血清中IFN-γ和IL-4的测定

以上Th淋巴细胞亚群的区分是通过流式细胞仪检测活细胞经刺激后表达的IFN-γ和IL-4。本研究亦采用ELISA法测定Th淋巴细胞分泌至血清中的IFN-γ和IL-4含量。试剂盒购自武汉华美生物工程有限公司，检验程序严格按照说明书进行。为确保检测结果的稳定性和可比性，所有标本所用的试剂均为同一批次，并同时检测。

1.7. 统计学分析

数据应用SPSS 10.0软件进行分析处理，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用成组t检验；计数资料以率（%）表示，组间比较采用χ²检验；两变量之间的相关性分析采用Pearson相关分析法。P < 0.05为差异有统计学意义。

2. 结果

2.1. TD患儿T淋巴细胞亚群的变化

TD组CD3⁺细胞即总T淋巴细胞的百分比低于对照组，差异有统计学意义（P < 0.05）。T淋巴细胞亚群中CD3⁺CD4⁺细胞即Th淋巴细胞的百分比低于对照组，差异有统计学意义（P < 0.001）；CD3⁺CD8⁺细胞即Ts淋巴细胞的百分比高于对照组，差异有统计学意义（P < 0.001）；Th/Ts比值明显降低，差异有统计学意义（P < 0.001）。见表 1和图 1。

1.

两组T淋巴细胞亚群的测定结果 （x±s，%）

组别	例数	总T淋巴细胞	Th淋巴细胞	Ts淋巴细胞	Th/Ts比值
对照组	80	68±7	36±6	26±5	1.4±0.4
TD组	150	66±7	29±6	30±6	1.0±0.4
t值		2.06	8.59	4.82	7.66
P值		0.04	< 0.001	< 0.001	< 0.001

1.

两组T淋巴细胞亚群的比较

A、D表示CD45⁺淋巴细胞的表达，见绿色线条圈起部分。B、E表示CD45⁺CD3⁺细胞的表达，代表的是总T淋巴细胞，见红色线条圈起部分，显示TD组总T淋巴细胞的百分比低于对照组。C、F中CD45⁺CD3⁺ CD4⁺细胞代表的是Th淋巴细胞，见红色线条圈起部分，显示TD组Th淋巴细胞的百分比低于对照组；CD45⁺CD3⁺CD8⁺细胞代表的是Ts淋巴细胞，见绿色线条圈起部分，显示Ts淋巴细胞的百分比高于对照组。

2.2. TD患儿总IgE、ASO以及T淋巴细胞亚群的异常率

依据我院相关实验室检测的正常参考值（总IgE：0~87 IU/mL；ASO：0~200 IU/mL；总T淋巴细胞：55%~84%；Th：31%~60%；Ts：13%~41%），TD患儿血清中总IgE值的异常率比对照组增高，差异有统计学意义（P < 0.01），ASO值异常率也较对照组升高，差异有统计学意义（P < 0.05）。TD组T淋巴细胞亚群中Th淋巴细胞的异常率高于对照组，差异有统计学意义（P < 0.001）；而总T淋巴细胞和Ts淋巴细胞的异常率两组比较差异无统计学意义（P > 0.05）。见表 2。

2.

两组总IgE、ASO以及T淋巴细胞亚群的异常率

[n（%）]
组别	例数	总IgE	ASO	Th淋巴细胞	总T淋巴细胞	Ts淋巴细胞
对照组	80	15(18.8)	5(6.2)	13(16.2)	1(1.2)	5(6.2)
TD组	150	59(39.3)	23(15.3)	103(68.7)	8(5.3)	11(7.3)
χ2值		10.13	4.03	> 10.83	2.31	0.09
P值		0.001	0.04	< 0.001	0.13	0.76

2.3. TD患儿T淋巴细胞亚群水平和YGTSS评分的关系

相关性分析显示，TD患儿T淋巴细胞亚群中Th淋巴细胞水平越低，YGTSS分数越高，即抽动症状越严重，两者呈负相关关系（r=-0.3945，P < 0.001）；而Ts淋巴细胞的水平和YGTSS评分无明显相关性（r=0.1208，P > 0.05）。

2.4. 两组儿童Th淋巴细胞亚群的比较

流式细胞仪检测两组儿童Th淋巴细胞亚群的结果显示：TD组Th1淋巴细胞百分比明显高于对照组，Th2淋巴细胞百分比较对照组明显降低，差异均有统计学意义（P < 0.001），见图 2和表 3。ELISA方法测定血清中的IFN-γ和IL-4含量显示：与对照组相比，TD组Th1淋巴细胞分泌的IFN-γ浓度有所上升，Th2淋巴细胞分泌的IL-4浓度有所下降，但两组间二者比较差异无统计学意义（P > 0.05），见表 3。

2.

两组Th淋巴细胞亚群的比较

A、E中R1区表示淋巴细胞；B、F中R2区表示CD3⁺细胞，代表的是总T淋巴细胞；C、G中R3区表示CD3⁺CD8^-细胞，代表的是Th淋巴细胞；D、H中IFN-γ⁺代表的是Th1淋巴细胞，IL-4⁺代表的是Th2淋巴细胞，显示TD组Th1淋巴细胞的百分比高于对照组，而Th2淋巴细胞的百分比低于对照组。

3.

两组Th淋巴细胞亚群的测定结果 （x±s）

组别	例数	流式细胞仪检测(%)			ELISA检测(pg/mL)
		Th1	Th2		IFN-γ	IL-4
对照组	40	8.2±2.5	2.4±1.4		4.7±2.0	4.3±1.9
TD组	40	17.8±6.4	1.2±0.7		5.1±2.6	4.0±2.2
t值		8.77	4.83		0.77	0.68
P值		< 0.001	< 0.001		0.44	0.50

3. 讨论

近年发现TD病例有明显增加的趋势，其确切病因仍不清楚，可能与遗传、神经递质失衡以及心理和环境等多因素有关^[5-7]。TD患儿在过敏季节或病原体感染后，经常出现症状加重或复发的现象，提示免疫功能的异常可能与TD的发生密切相关。国内外均有报道TD患儿存在免疫应答的过度活跃以及免疫功能紊乱的情况^[8-10]。本研究发现，在TD患儿中，总T淋巴细胞较对照组降低，说明TD患儿存在细胞免疫功能的异常。而在T淋巴细胞亚群中，TD患儿Th细胞明显减少、Ts细胞明显增加，因此Th/Ts比值显著下降，说明TD患儿细胞免疫功能的异常主要表现为T淋巴细胞亚群的平衡失调。本研究中TD患儿Th水平和Th/Ts比值显著降低与既往文献报道一致^[11-12]，显示出Th淋巴细胞表达低下在TD中的重要作用。本研究还根据我院相关实验室指标检测的正常参考值范围，比较了TD患儿血总IgE、ASO以及T淋巴细胞亚群的异常率，结果显示血清总IgE和ASO的异常率均有升高，尤其是IgE水平，说明过敏和感染等环境因素对TD发病率的增加有明显作用；更为重要的是，Th淋巴细胞的异常率在TD组中明显增加，而总T淋巴细胞和Ts淋巴细胞的异常率按照我院的正常参考值标准却未发现明显变化。这些结果提示过敏或感染等各种病因可能是通过影响机体Th淋巴细胞的功能，参与神经免疫的过程，最终导致TD的发生。

目前广泛应用于临床的YGTSS是美国耶鲁大学研制的评估抽动症状的量表，该量表从多个维度反映了TD的严重程度，包括抽动症状的各个方面：数量、频率、强度、复杂性、干扰程度以及总体缺损率，分级准确。然而该量表只是经诊医师通过家长对抽动表现的主观观察和描述来进行量化评估，临床上缺乏实验室的判断TD严重程度的客观依据。因此本研究分析了Th淋巴细胞水平和YGTSS评分的相关性，发现Th淋巴细胞百分比与YGTSS总分呈负相关, 即Th淋巴细胞水平越低，临床上YGTSS评分越高，抽动症状越严重；而Ts淋巴细胞的水平和YGTSS分值无明显相关性。这些结果表明Th淋巴细胞水平可作为反映TD患儿病情严重程度的一个良好客观指标。

本研究进一步分析了TD患儿Th淋巴细胞亚群的变化。Th淋巴细胞可以分为Th1和Th2两种亚群的细胞，它们通过分泌各自不同的细胞因子相互调节并处于相对平衡的状态以维持机体正常的免疫功能。当上述平衡被打破时，可引起异常的免疫应答^[13]。Th1细胞主要分泌IFN-γ，参与细胞免疫；Th2细胞的功能主要是辅助B淋巴细胞产生抗体，参与体液免疫，以分泌IL-4为特征。本研究采用流式细胞仪检测Th淋巴细胞亚群，结果显示：在病例组，Th1细胞增多，Th2细胞减少，提示TD儿童中存在的免疫异常可能以细胞免疫为主。这种Th1和Th2的比例失调会导致过度的免疫应答，促进非特异性炎症的发生，使神经组织受损，从而在该疾病的发展过程中起重要作用。本研究也应用ELISA法测定血清中IFN-γ和IL-4的浓度，结果与流式细胞仪检测相符：TD组IFN-γ浓度有所上升，IL-4浓度有所下降，但两组间二者比较差异无统计学意义，可能和Th淋巴细胞未经刺激，外分泌细胞因子量甚微有关。由于ELISA法较为简便，今后可以尝试先激活Th淋巴细胞，再对其分泌的这些细胞因子进行检测。

综上所述，Th淋巴细胞及其亚群的平衡失调导致的细胞免疫异常可能与儿童TD的发病关系密切；而且Th淋巴细胞水平可作为评估TD严重程度的客观检验指标。因此，临床上有望通过调节TD患儿Th淋巴细胞及其亚群的功能，以达到治疗该疾病的良好效果。

Biography

侯晓君, 男, 博士, 副主任医师。Email:houxiaojun111@189.cn

Funding Statement

福州市科技计划项目社会发展项目（2016-S-128）